临床细菌检验工作的基本要求和技术
一.对临床细菌检验人员的要求
1.负责鉴定及签发报告的主管技术人员应通晓诊断细菌学的全面知识。
2.一般细菌室工作人员均应具备细菌传染、消毒、灭菌的知识。
3.通晓细菌室守则，并严格遵守。
4.负责人应不断更新知识，了解细菌学检验的新进展。
5.定期或随时与临床医师联系，主动参与临床病例讨论，了解病情及治疗情况，达到细菌检验与临床的密切联系。
6.工作人员应定期进行健康体检及必要的预防接种，增强自身抵抗能力。
二、工作人员守则
在细菌室工作人员应注意，既不要给室内带来污染，也不要被室内的微生物感染。工作人员必须遵守以下规则：
1.穿专用的工作衣、帽入室；必要时应戴口罩。
2.不允许无关人员进入实验室。
3.室内禁止饮食、吸烟、闲谈等非专业活动。
4.养成在室内手不触及口、脸、头发及躯体的习惯。
5.操作中不可说话，以免口中飞沫污染标本。
6.每次完成工作和离开实验室前，应用肥皂洗手，接触了致病菌类，须用消毒剂消毒手。
7.个人物品不许带入室内。
8.当工作环境被细菌培养物污染，必须用适当的强消毒液泼撒覆盖污染物，并报告主管人员采取必要的措施。
9.工作人员被细菌培养物污染，应用弱或中等消毒剂清洗，必要时应给予药物治疗，并向主管负责人报告，进一步采用特殊措施。
基本染色方法
染色的第一步是制作涂片。菌液涂片时，用接种环沾取菌液点在载玻片上，标本可直接在玻片上涂布。菌落涂片时，先取生理盐水 1滴，置玻片上，用接种针挑取菌落，在盐水中涂布。涂片时必须注意应轻轻操作。猛烈的动作会改变菌细胞原有的排列形式，或造成细菌鞭毛脱落，影响结果的准确性。制备的涂片应自然干燥，并经火焰固定，固定温度不宜过高，以玻片背面接触手背不烫为准，否则可能使细胞形态改变。将固定后的涂片进行染色。
一、革兰染色
本染色是最基本的染色法，可用于标本涂片或菌落涂片。染色结果将细菌分为革兰阳性(紫色)和革兰阴性(红色)两类。
试剂
1. 结晶紫溶液
A液： 结晶紫 2g
95％乙醇 20ml
B液： 草酸铵 0.8g
蒸馏水 80ml
需在用前24h将A液、B液混合，过滤后装入试剂瓶内备用。
2．碘液
碘 1g
碘化钾 2g
蒸馏水 300ml
碘与碘化钾混合并研磨，加入几毫升水，使其逐渐溶解，然后研磨，继续加入少量蒸馏水至完全溶解。最后补足水量。也可用少量蒸馏水，先将碘化钾完全溶解，再加入碘片，待完全溶解后，加水至300ml。
3．脱色液：95％乙醇。
4．复染液
A. 贮存液： 沙黄 2.5g
95％乙醇 100ml
B. 应用液： A液 10ml
蒸馏水 90ml
染色方法：
1．涂片经火焰固定，加结晶紫液染1 min，清水冲去染液。
2．加碘液染l min，水洗。
3．加脱色液，不时摇动约10～30s，至无紫色脱落为止，水洗。
4．加复染液，染30s，水洗。
5．干后镜检。
二、抗酸染色
抗酸染色直接用于痰标本时，可以适当增加标本涂片的厚度，以提高检出率。染厚涂片时，须掌握复染色时间。如果背景过深，影响镜检。
奴卡菌及放线菌可呈弱抗酸性，取培养菌落涂片染色时，呈现两种现象，视野中有些菌细胞阳性，另外一些则阴性；有时同一个菌体上，红色的深浅亦有不同，观察时应予注意。
抗酸染色有两种常用方法：① 碱性复红法又称萋纳(Ziehl—Neelsen)法。 ② 荧光染料金胺O法(也称金胺O-罗丹明B法)。
(一) 碱性复红染色法
试 剂
1．萋纳石炭酸复红溶液
碱性复红乙醇饱和溶液 10ml
5％石炭酸溶液 90ml
2．脱色剂 *
浓盐酸 3ml
95％乙醇 97ml
3．复染液(吕弗勒美蓝液)
美蓝乙醇饱和溶液 30ml
10％氢氧化钾 0.1ml
蒸馏水 100ml
染色方法
1．涂片经火焰固定，加石炭酸复红溶液，徐徐加热至有蒸汽出现，切不可沸腾。染5 min(若染色奴卡菌需要加长时间)，水洗。
2．加脱色剂，不时摇动玻片至无红色脱落为止，水洗。
3．加复染液，染0.5～l min，水洗。
4．干后镜检。分枝杆菌呈红色，背景为蓝色。
*：奴卡菌、放线菌标本染色时，脱色剂改用2％硫酸水溶液。
(二)金胺O-罗丹明B染色法
染 剂
1．罗丹明B液：罗丹明B 0.1g加蒸馏水100ml；
2．0.1％金胺O液：金胺O 0.1g加蒸馏水95ml，再加入纯石炭酸5ml，混匀；
3．3％盐酸酒精；
4．稀释美蓝液：吕弗勒美蓝液10ml，加蒸馏水90ml，混匀。
方 法
1．涂片固定后加第1液30～90s。
2．弃去第1液后加第2液染15min。
3．用第3液脱色1～2min，水洗。
4．滴加第4液染30s，水洗，待干，荧光抗酸菌在暗背景中呈现金黄色荧光。
三、鞭毛染色
用于观察菌体上有无鞭毛、鞭毛在菌体上的位置以及鞭毛的数量。在细菌鉴定中，特别是非发酵菌的鉴定中很重要。
鞭毛染色可以直接从平板上挑选菌落，或从斜面上刮菌苔涂片即可，但必须注意动作尽量轻，以免鞭毛从菌体上脱落。菌落应是生长在营养较好的琼脂平板(如血平板、营养琼脂)上的过夜培养物。不可采用有抑制剂的选择性培养基，如中国蓝、麦康凯、SS琼脂等。观察鞭毛时，应耐心寻找整个涂片上的菌细胞，因为并不是涂片上每个细菌细胞上的鞭毛特性及数量都一样，应以鞭毛数量最多的菌细胞为准。
鞭毛染色(改良Ryu法)
试剂
A液： 5％石炭酸 10ml
鞣酸 2g
饱和硫酸铝钾液 10ml
B液： 结晶紫酒精饱和液
应用液：A液10份，B液1份，混合，室温存放。
染色方法
1．玻片的处理：要求用新的载玻片。用前须在95％酒精中浸泡24小时以上。用时从酒精中取出，以干净纱布擦干后使用。
2．在玻片上滴蒸馏水两滴。一张玻片上可同时制2个涂片。
3．用接种环挑取血平板上菌落少许，将细菌点在玻片上的蒸馏水滴的顶部。一般只需点一下，仅允许极少量细菌进入水滴，不可搅动，以免鞭毛脱落。
4．玻片置室温自然干燥。
5．滴加染液于玻片上，染色。
6．约10～15min后，用蒸馏水缓慢冲去染液。冲洗时应避免使染液表面的金属光泽液膜滞留在玻片上，影响镜检。
7．玻片自然干燥后，镜检时应从涂片的边缘开始，逐渐移向中心。寻找细菌较少的视野，鞭毛容易观察。细菌密集的地方，鞭毛被菌体挡住，不易观察。
四、异染颗粒染色
用于白喉棒状杆菌染色，异染颗粒可明显地被显示出来。
标本直接涂片或细菌涂片均可用改良阿伯特(Albert)法染色来观察异染颗粒。
试 剂
甲液： 甲苯胺蓝 0.15g
孔雀绿 0.2g
冰醋酸 1ml
95％乙醇 2ml
蒸馏水 100ml
将各染料先溶于乙醇，然后加入水与冰醋酸的混合液中，充分混匀。静置24h后过滤备用。
乙液： 碘 2g
碘化钾 3g
蒸馏水 300ml
先将碘化钾加少许蒸馏水(约2m1)，充分振摇，待完全溶解，再加入碘，使完全溶解后，加蒸馏水至300ml。
染色方法
1. 涂片经火焰固定，加甲液，染3～ 5 min。水洗。
2．滴加乙液，染l min。水洗。
3．干后镜检，菌体呈绿色，异染颗粒呈蓝黑色。
五、墨汁荚膜染色
用于观察菌体有无荚膜结构，借此鉴定某些菌，如新型隐球菌。
传统的方法是用印度墨汁，但目前国内无售。常规工作可以用墨汁或墨水代替，但应注意颗粒不能太粗，否则影响观察结果。有人用5％黑色素(nigrosin)水溶液做染料，效果较好。
试 剂
印度墨汁或5％黑色素水溶液。
染色方法
将标本与1滴染色液在载玻片上混合，加上盖玻片，轻轻压一下，使标本混合液变薄。在低倍镜下寻找有荚膜的菌细胞。找到后，转换高倍镜确认。
葡萄球菌属
一、常规鉴定
葡萄球菌的鉴定：首先须与其他的革兰阳性球菌鉴别，然后再作属内种的鉴定。
(一) 与其他革兰阳性球菌鉴别
临床标本中常见到的革兰阳性球菌，除葡萄球菌属外，还有微球菌属和气球菌属等。所以，在菌属内菌种鉴定之前，首先与这几属细菌鉴别(见表略)。
1．与链球菌鉴别：葡萄球菌与链球菌的区别如下：在镜下，葡萄球菌以单、双、葡萄状排列，菌体呈圆形。链球菌以成单、双、链状排列，菌体形态为圆形或椭圆形。葡萄球菌触酶试验阳性，链球菌则阴性。
2．与微球菌的鉴别：实验室常用的鉴别依据是形态和发酵葡萄糖产酸。在镜下，葡萄球菌以葡萄状排列为主，菌体较小；微球菌以四联排列为主，且菌体较大。葡萄球菌发酵葡萄糖产酸试验阳性，微球菌阴性。此外杆菌肽、呋喃唑酮敏感试验有利区别两属菌种。
(二) 临床8种常见葡萄球菌的鉴别
目前葡萄球菌已被命名有27个种。临床标本中最常见有意义菌种是金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、溶血葡萄球菌、里昂葡萄球菌、施氏葡萄球菌、中间葡萄球菌和猪葡萄球菌。首先用凝固酶试验将其分为凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌(包括中间和猪葡萄球菌)和凝固酶阴性的其他葡萄球菌，然后用新生霉素敏感试验。推断新生霉素耐药为腐生葡萄球菌。下表列出了关键鉴定试验来区别上述8个菌。
二、试验方法
(一)触酶试验(过氧化氢酶试验)
试剂：3％H2O2溶液，置棕色瓶内于4℃阴暗处保存。
方法：先挑取固体培养基上的菌落，置于洁净的玻片上，然后滴加3％过氧化氢溶液1～2滴。静置之，lmin内产生大量气泡的为阳性，不产生气泡的为阴性。
(二)葡萄球菌凝固酶和凝聚因子试验
葡萄球菌凝固酶试验被广泛地用于常规鉴定金黄色葡萄球菌与其他葡萄球菌。试管法凝固酶试验称为葡萄球菌凝固酶，玻片法为检测凝聚因子。
1．凝聚因子试验：取1滴蒸馏水于洁净的玻片上，用接种环挑取待检菌一环置于蒸馏水中，制成浓的菌悬液，无自凝现象。然后加一环家兔血浆混合，10s内观察结果，出现明显细菌凝块为阳性，否则为阴性。如超过 10s可出现假阳性，有10％一15％金黄色葡萄球菌呈假阴性，因此必须用试管法验证凝聚因子试验。
操作过程中的注意点：
(1)10s内观察结果。
(2)必须制备浓厚的均匀菌悬液。
(3)用EDTA抗凝的兔血浆为最好。
(4)加血浆后不要再混搅，以免细菌凝块分散变小。
(5)生长在高盐培养基上的菌落可出现自凝或假阳性。
2．葡萄球菌凝固酶试验：用生理盐水将血浆4倍稀释，取0.5ml。然后挑取3～5个菌落于稀释血浆中，成浓菌悬液。置37℃水浴，3～4h后读取结果，凝固者为阳性。若阴性，继续观察到24h，不凝固者为阴性。试验应同时作阳性、阴性对照。
试管法葡萄球菌凝固酶试验阳性者，应见到明显的纤维蛋白凝胶块，出现羊毛状或纤维状沉淀物并非真正凝固，应判为阴性。中间型葡萄球菌、猪葡萄球菌需要较长时间孵育，才可出现阳性。凝固酶试验应考虑下述情况：
①某些金黄色葡萄球菌产生溶纤维蛋白酶，溶解纤维蛋白凝块。
②所用血浆缺乏纤维蛋白原。
③试验菌株不纯。
(三)碳水化合物氧化、发酵试验 (OF试验)
葡萄球菌的OF试验应使用专用配方，不可与非发酵菌用的OF管混用。培养基用的指示剂必须用水配制，因为个别菌株能分解乙醇产酸。
培养基：
酵母浸膏 0.1g
胰胨 1g
牛肉浸液 l00ml
0.2％溴甲酚紫溶液 lml
校正pH7.0，按常规方法加入1％的碳水化合物，分装，灭菌，备用。
溴甲酚紫的配制：溴甲酚紫lOOmg， 0.01mol的NaOH 18.5ml，加水至50ml。
方法：挑取待检菌落，接种于2支O-F培养基管中，发酵管加灭菌液体石蜡油约 lcm深，氧化管不加。35℃孵育24h后观察，培养基变黄即产酸。结果判定如下：
代谢型 加石蜡 不加石蜡
发酵 产酸 产酸
氧化 不变色 产酸
(四)新生霉素耐药试验
方法：挑取待检菌菌落数个，制成相当 0.5号麦氏管(McFarland)浓度菌液，棉拭子浸透，挤去多余液，均匀涂在M—H平板上，贴上含5ug／片的新生霉素纸片，35℃孵育 16～20h，抑菌环直径≤16mm为阳性(耐药)。试验时应以金黄色葡萄球菌 ATCC25923做阴性(敏感)对照，以确认纸片是否有效。
(五)氧化酶(改良法)试验
试剂：
四甲基对苯二胺 (TMPD) (Tetramethylphenylenediamine) 6.0g
二甲基亚砜 (DMSO) (Dimethy sulfoxide) 100.0ml
溶解TMPD于DMSO中，置于避光玻塞瓶中，可在室温中保留几个星期。
方法：被检菌株移种于7％羊血琼脂上，30℃需氧条件下孵育15～18h，刮取菌落涂布于无色滤纸片上，加1滴上述试剂，阳性者在2min内呈深蓝色。
若被测菌株移种在蛋白胨酵母浸出液琼脂上，至少孵育3天以上，才可检测，阳性反应5～10min出现。
链球菌属
一、常规鉴定
(一)属间鉴别
临床标本检到革兰阳性球菌、触酶阴性，除链球菌属外，尚有6个菌属，是：
肠球菌属 Enterococcus
乳球菌属 Lactococcus
无色藻菌属 Leuconostoc
平面球菌属 Pediococcus
孪生球菌属 Gemella
气球菌属 Aerococcus
在鉴别上述菌属时，关键是：①革兰染色。上述菌属的革兰染色特性相似，若从琼脂平板上涂片染色，无色藻菌属中某些菌种的形态呈现球杆形、杆形，容易与乳杆菌属菌种相混淆，后者触酶亦阴性。若生长在盐肉汤涂片，最容易出现不一致性。②触酶试验。目的是与葡萄球菌属和口腔球菌属鉴别。属间鉴别参见下表。 (略)
(二)属内鉴别
链球菌属内鉴别，首先观察在血液琼脂平板上的溶血环，是β溶血型，或非β溶血型，参照这二类溶血型菌种的鉴别。
1．β溶血链球菌的鉴定：β溶血型链球菌的鉴定都是检测特异多糖抗原称为链球菌群多糖抗原来分群，可采用商业性试剂盒，当前血清学诊断方法尚未普及之前，传统的对β溶血链球菌的鉴别仍是需要的。
A、B、D、G群细菌，一般可用杆菌肽、CAMP、胆汁七叶苷及PYR、VP等试验区别 (见表略)。
2．非β溶血链球菌鉴别
肺炎链球菌的鉴定：生长在血琼脂平板上的菌落细小，圆形，表面光滑、灰白色、边缘整齐，半透明，开始扁平以后中心塌陷，呈脐窝状。菌体呈矛头状成双排列。该菌对Optochin敏感和胆汁溶菌试验阳性。
3．牛链球菌的鉴定：具有D群多糖抗原，6.5％NaCl不生长，PYR阴性，胆汁七叶苷阳性，与其他草绿色链球菌鉴别见下表(略)。
营养变异链球菌是草绿色链球菌的营养变种，在普通肉汤或琼脂平板上生长不良(通常发现在血液培养瓶中)。若培养基中加入吡哆醛或做“卫星现象”试验容易被发现，有二个种，即缺陷链球菌S．defectivus，毗邻链球菌S.adjacens。
草绿色链球菌的鉴定：革兰阳性球菌，触酶阴性，非β溶血、胆汁溶菌阴性，Optochin阴性，不存在B、D群抗原，6.5％NaCl肉汤不生长，PYR阴性，10℃，45℃不生长，胆汁七叶苷阴性，万古霉素敏感。该类链球菌种较多，目前临床仅鉴定到群，参见下表(略)。
咽峡炎链球菌是未分群的链球菌，被认为是“米勒链球菌”的同义词，有β溶血的菌种，属于A、C、F、G群，也有非β溶血菌种，在A、C、G群链球菌中有小菌落型菌株。非β溶血，带有相同的Lancefield抗原，属于草绿色链球菌(“米勒”群)细菌，有3个种；米勒链球菌、中间链球菌、星座链球菌。
(三)与链球菌属相关菌属的描述
1．乳球菌属：原链球菌属中乳链球菌现成为乳球菌属。乳球菌和乳脂乳球菌在制酪和粮食工业生产中使用。临床标本中也常见到。该属菌种与肠球菌相似，唯一不同点是45℃不生长。
2．孪生球菌属：原麻疹链球菌现转入孪生球菌属，另一种是溶血孪生球菌。该属菌种曾从临床标本中检到，见于临床感染如心内膜炎。其特点是生长缓慢，可能被误认为营养缺陷链球菌，应用“卫星现象”试验区别开来。菌种鉴定，参照下表所示(略)。
3．平面球菌属：该属菌种对万古霉素耐药，PYR阴性，发酵葡萄糖不产气，胆汁七叶苷、精氨酸阳性，含有D群抗原，不发酵乳糖，在含盐肉汤中生长缓慢，属内鉴别参见下表(略)。乳酸平面球菌和戊糖平面球菌曾从临床标本中分离到。
4．无色藻菌属：该属菌种万古霉素耐药，PYR、LAP阴性，发酵葡萄糖(MRS肉汤)产气，有4个菌种曾从临床标本中检到，种间鉴别参照下表(略)。
二、试验方法
(一)溶血性检查
溶血性是鉴定球菌最常用的项目，也是鉴定过程中重要的一步。1919年Brown对溶血性进行了描述。
α溶血：或称甲型溶血，在血平板上，菌落周围部分红细胞被破坏，呈现一个草绿色环。
β溶血：或称乙型溶血，在血平板上，菌落周围红细胞完全溶解，呈现一个清楚透明溶血环。
γ溶血：或称丙型溶血，血平板上，菌落周围无红细胞溶解，因而无溶血环。
溶血性的识别可在血平板表面菌落周围和穿刺处通过肉眼观察，也可用显微镜观察。除在分离血平板上观察菌落周围的溶血性外，还可用以下方法确认。
材料：羊血平板。
方法：将标本接种于羊血平板上，用接种针在已接种过的血平板上扎2～3处，使细菌被接种到琼脂层深处，35℃孵育过夜。
观察结果：在接种针穿刺过处，羊红细胞完全溶解，形成无色透明区，为β溶血。羊红细胞部分溶解或不溶解呈草绿色的环，为α溶血。不溶解无溶血环为γ溶血。
(二) Optochin敏感试验
材料：Optochin (ethylhydrocupreine HCI。)纸片(直径6mm)，每片含5μg。血平板。
方法：挑取被检菌落，涂在血平板上，贴 Optochin纸片于接种处，35℃，烛缸孵育18h。
观察结果：抑菌环直径≥14mm为敏感，推断肺炎链球菌。
抑菌环直径≤14mm时参照胆汁溶菌，或为其他草绿色链球菌。
(三) 杆菌肽敏感试验
材料：含0.04U／片的杆菌肽纸片，血平板。
方法：挑取被检菌落，密涂于血平板上，接种量应大，以免出假阳性。贴上杆菌肽纸片，35℃过夜。
观察结果：形成抑菌环为敏感，则被检菌推断为A群链球菌。
(四) CAMP试验
材料：血平板，金黄色葡萄球菌 ATCC25923。
方法：在血平板上，用金黄色葡萄球菌划种一条直线，再将被检菌距金黄色葡萄球菌 3mm处垂直接种一短线。用同样方法接种阴性和阳性对照菌。35℃孵育过夜。
观察结果：在被检菌接种线与金葡菌接种线之间有一个矢形(半月形)加强溶血区，此即CAMP试验阳性。阴性无加强溶血区。
(五) 胆汁-七叶苷试验(平皿法或斜面法)
培养基：
牛肉膏 3g
七叶苷 1g
蛋白胨 5g
枸橼酸铁 0.5g
胆盐 40g
蒸馏水 1000ml
琼脂 1％
牛肉膏、蛋白胨和琼脂溶于400ml蒸馏水中，胆盐溶于400ml蒸馏水中，枸橼酸铁溶于l00ml蒸馏水中，三者混合，加热充分溶解后，高压灭菌121℃ 15min。七叶苷溶于l00ml蒸馏水，过滤除菌，以无菌手续加到培养基中，倾倒平皿或斜面。
方法：接种被检菌1—3个菌落，涂划开，置35℃下，孵育24～48h。
观察结果：培养基变黑色或棕褐色为阳性，不变色为阴性。
注意事项：接种细菌量不能过大。本试验是测定细菌在胆盐中生长情况及同时分解七叶苷的能力，如接种菌量过大，细菌不需要生长而本身固有的酶足以造成七叶苷分解，出现假阳性结果。
(六)七叶苷试验
培养基：
蛋白胨 5g
七叶苷 3g
K2HPO4 1g
枸橼酸铁 0.5g
蒸馏水 1000ml
将上述成分加热溶解，分装试管，高压灭菌12rClomin。
方法：接种被检菌于培养基中，35℃过夜。
观察结果：培养基变黑为阳性，不变为阴性。
(七) 6.5％NaCl生长试验
培养基
NaCl 6.5g
牛肉粉 0.3g
葡萄糖 0.1g
蛋白胨 1g
琼脂粉 1.8g
蒸馏水 l00ml
溴甲酚紫指示剂适量
调整pH7.4，121℃ 15min灭菌后制成平皿或斜面。
方法：接种被检菌，35℃孵育过夜。
观察结果：培养基上生长出菌落并变黄色为阳性，不变色为阴性。
注意点：本试验是测定细菌在高盐中的生长能力，葡萄糖作为是否生长的指示剂。细菌接种量不能过大，否则细菌并不需要繁殖即可使葡萄糖产酸，培养基变色，导致假阳性结果。
(八) 色素试验
色素试验在鉴定B群链球菌的几个方法中，特异性最好。这是Noble改良的Islam法。
培养基：
淀粉 10g
胨 23.0g
NaH2PO4 1.48g
Na2HP04 5.75g
琼脂 l0g
水 1000ml
调pH7.4，121℃15min灭菌后，加入 10ml灭活马血清，倾制平板或高层琼脂。接种细菌，35℃过夜培养。
观察结果：细菌菌落及周围的培养基呈黄色为阳性。
肠球菌属
一、常规鉴定
为便于鉴定，将肠球菌分成3个组，主要根据甘露醇、山梨醇、山梨糖、精氨酸来分群。
Ⅰ群菌种分解甘露醇、山梨醇、山梨糖。精氨酸水解酶阴性。
Ⅱ群菌种发酵甘露醇、水解精氨酸。不分解山梨糖，山梨醇不定。
Ⅲ群菌种水解精氨酸，既不发酵甘露醇与山梨醇，亦不分解山梨糖。
二、试验方法
丙酮酸盐利用试验
酵母浸出粉 5g
磷酸氢二钾 5g
氯化钠 5g
丙酮酸钠 10g
麝香草酚蓝 104mg
蒸馏水 1000ml
除指示剂外，上述试剂加热溶解，调整 pH7.1～7.4后，再加指示剂，用13mm×l00mm试管分装，高压121℃ 15min。
方法：接种被检菌株于上述培养基中，孵育35℃ 7天以上，培养基由绿色变成明显黄色为阳性，如仍为绿色或黄绿色判定阴性。
嗜血杆菌属
一、常规鉴定(略)
2．属内鉴别可利用分离培养时，对X、 V因子的需要和溶血性可初步区别不同的嗜血杆菌种。
进一步的鉴别可通过生化试验来确定到种。流感嗜血杆菌发酵木糖，与埃及嗜血杆菌木糖不发酵相区别。杜克雷嗜血杆菌有特殊临床来源，所以较易诊断。属内种的鉴别见下表(略)。
(1) 流感嗜血杆菌和副流感嗜血杆菌的鉴定。
用金黄色葡萄球菌作“卫星”试验阳性。但应注意“副流感”只需V因子即生长。可同时用M—H平板作卫星试验，能在M—H平板呈卫星生长的菌可否定流感嗜血杆菌。二者也可用糖发酵试验加以鉴别。
(2) 作为院内感染病源追踪的流行病学的需要，对流感、副流感嗜血杆菌须鉴定到型。可用吲哚、尿素、鸟氨酸3个试验将“流感嗜血杆菌”分为8个生物型(详见表略)，或用血清学进行分型。
二、试验方法
1.卫星试验：挑取可疑菌落密涂划种于血平板上或M—H平板上，再将金黄色葡萄球菌点种或划种其上，35℃24h孵育。如葡萄球菌菌落邻近处被检菌的菌落较大，远离葡萄球菌菌落处的菌落小或不生长，即“卫星”试验阳性。在血平皿上划上葡萄球菌时，X，V因子都具备，在M-P,平板上接种葡萄球菌、只具备V因子。
2.糖发酵试验
培养基：1％糖的酚红肉汤，并补充所需生长因子，方法参考奈瑟菌鉴定。
3.吲哚(快速法)试验：在pH 6.8的磷酸缓冲液(0.05mol)中，加0.1％的L-色氨酸。大量接种被检菌，孵育4h后，加Kovacs试剂。
4.尿素酶试验
培养基：
KH2PO4 0.1g
K2HPO4 0.1％
NaCl 0.5g
0.2％酚红水溶液 0.5ml
蒸馏水 100ml
pH 7.0高压后加20％的尿素溶液 10.4ml。
方法：与其他菌相同。注意接种量要大，4小时观察结果。
肠杆菌科
一、常规鉴定
肠杆菌科虽然有100多个种，在临床常见的不过是其中的一部分，约20余种。从临床标本中分离的频率较高的是大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和奇异变形杆菌。对3个菌种的鉴别鉴定，实验室可用常规的方法，一般不困难。其他菌种应按规程的操作从属到种的步骤进行。
(一)与其他科属细菌的鉴别
革兰阴性杆菌除了肠杆菌科外，还有弧菌科和非发酵菌。所以，肠杆菌科的鉴定首先应注意与这些菌的鉴别。可用形态、葡萄糖氧化或发酵、氧化酶、鞭毛等特性加以区别，见表(略)。
(二)肠杆菌科的初步分群
可用两个试验将肠杆菌科初步分为二大类，即苯丙氨酸脱氨酶试验和葡萄糖酸盐试验(也可用V-P试验)，见表:(略)
(三)苯丙氨酸阳性菌属及种的鉴别
苯丙氨酸阳性、葡萄糖酸盐阴性的有变形杆菌属、普罗威登斯菌属、摩根菌属。
1．各属的鉴别：变形杆菌属、普罗威登斯菌属、摩根菌属的区别可用H2S、鸟氨酸、枸椽酸盐三个试验，其鉴别见表:
表 苯丙氨酸阳性的各属鉴别
试 验 变形杆菌属 普罗威登斯菌属 摩根菌属
H2S + - -
鸟氨酸 +/- - +
枸椽酸盐 +/- + -
2．变形杆菌属种的鉴别：变形杆菌属常见有三个种即普通变形杆菌、奇异变形杆菌、潘尼变形杆菌。产粘液变形杆菌仅从活的或死的吉普赛蛾幼虫中发现，与人类的关系未见报道。鉴别见表。
表 变形杆菌属内种的鉴别
试 验 普通变形杆菌 奇异变形杆菌 潘尼变形杆菌
靛基质 + - -
鸟氨酸 - + -
麦芽糖 + - +
3．普罗威登斯菌属种的鉴别：该属临床常见有3个菌种，即产碱普罗威登斯菌、斯图普罗威登斯菌、雷极普罗威登斯菌，其鉴别见表:
表 普罗威登斯菌属内种的鉴别
试 验 产碱普罗威登斯菌 斯图普罗威登斯菌 雷极普罗威登斯菌
尿素 - -/+ +
蕈糖 - + -
侧金盏花醇 + - +
4．摩根菌属的鉴定：摩根菌属常见1个种，即摩根摩根菌，其鉴定见”苯丙氨酸阳性的各属鉴别表”。
(四)苯丙氨酸阴性、葡萄糖酸盐阳性各属及种鉴别
1．葡萄糖酸盐阳性各属的鉴别：这类细菌有克雷伯菌属、肠杆菌属、沙雷菌属、哈夫尼亚菌属。可用动力、山梨醇、DNase、棉子糖等试验将其区别(见表)。
表5-3-28 葡萄糖酸盐阳性的各属的鉴别
试 验 克雷伯菌属 肠杆菌属 沙雷菌属 哈夫尼亚菌属
动力 - + + +
山梨醇 + +/- + -
Dnase - - + -
棉子糖 + + +/- -
枸橼酸盐利用 +a + + -
鸟氨酸脱羧酶 -d +b +c +
注：a．鼻硬结亚种、臭鼻亚种的某些菌株阴性。
b．聚团肠杆菌阴性。
c．芳香沙雷菌生物2群、普城沙雷菌、深红沙雷菌阴性。
d．解吗氨酸克雷伯菌阳性。
2．克雷伯菌属种的鉴别：克雷伯菌属有肺炎克雷伯菌(亚种)、臭鼻亚种、鼻硬结亚种、产酸克雷伯菌。肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌是临床中分离较多的，二者的区别在靛基质。另外，两个亚种虽然临床不多见，但已从臭鼻患者、呼吸道慢性病患者以及鼻硬结患者中分离到，因此，鉴别它们也是有一定的临床意义。可用甲基红、赖氨酸、丙二酸盐鉴别(见表5—3—29略)。
3．肠杆菌属种的鉴别：肠杆菌属常见有 5个菌种：阴沟肠杆菌、坂崎肠杆菌、聚团肠杆菌、产气肠杆菌、格高菲肠杆菌。在其鉴别上，氨基酸脱羧酶试验的价值较大。坂崎肠杆菌、聚团肠杆菌可产生黄色素，为鉴定提供了较为明显的特征。聚团肠杆菌还有一个特点，就是赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸皆为阴性。坂崎肠杆菌与阴沟肠杆菌的区别在于山梨醇，坂崎肠杆菌为阴性，阴沟肠杆菌为阳性。格高菲肠杆菌与产气肠杆菌也很相似，可用尿素酶和山梨醇相区别。前者尿素酶阳性，山梨醇阴性；后者尿素酶阴性，山梨醇阳性。5个种的鉴别详见表。
表5-3-30 肠杆菌属种的鉴别
试 验 阴沟肠杆菌 坂崎肠杆菌 聚团肠杆菌 产气肠杆菌 格高菲肠杆菌
赖氨酸 - - - + +
鸟氨酸 + + - + +
精氨酸 + + - - -
山梨醇 + - -/+ + -
尿素酶 +/- - -/+ - +
黄色素 - + + - -
4．沙雷菌属种与哈夫尼亚菌属种的鉴别：沙雷菌属有8个种，但临床只有粘质沙雷菌相对较多见，可用阿拉伯糖、木糖与其他沙雷菌相鉴别(见表)
表 粘质、液化沙雷菌的鉴别
试 验 粘质沙雷菌 液化沙雷菌 红色沙雷菌
阿拉伯糖 - + +
棉子糖 - +/- +
木 糖 - + +
鸟氨酸 + + -
哈夫尼亚菌属只有1个种，即蜂房哈夫尼亚菌，其特点是不分解乳糖(偶也有分解的，约5％)，发酵葡萄糖产气，动力“+”，靛基质“一”，V—P“+”，枸橼酸盐“+”，H：S“一”，赖氨酸“十”，鸟氨酸“十”，山梨醇“一”，棉子糖“一”。该菌种的生化反应在25℃比较稳定，与其他菌属的区别见前表5—3—22。
(五)苯丙氨酸、葡萄糖酸盐阴性的各属及种的鉴别
1．这一类菌属有埃希菌属、志贺菌属、沙门菌属、枸橼酸杆菌属、爱德华菌属、耶尔森菌属。他们的区别可用H2S、动力、枸橼酸盐、靛基质、赖氨酸、尿素6个试验相鉴别(见表5—3—32略)。
2．枸橼酸杆菌属种的鉴别：该属常见有弗劳地枸橼酸杆菌、异型枸橼酸杆菌、丙二酸盐阴性枸橼酸杆菌等。三者的鉴别用靛基质、 H2S、侧金盏花醇(见表5-3-33)。
表5-3-33 枸橼酸杆菌属种的鉴别
试 验 弗劳地枸橼酸杆菌 异型枸橼酸杆菌 丙二酸盐阴性枸橼酸杆菌
H2S +/- - -
靛基质 - + -
侧金盏花醇 - + -
丙二酸盐 -/+ + -
KCN生长 + - +
3. 爱德华菌属，虽有3个种，但只有迟缓爱德华菌具有临床意义。其特点是不分解乳糖，分解葡萄糖产气，产生H2S，动力“+”，靛基质“+”，V-P“-”，枸橼酸盐“-”，赖氨酸“+”，鸟氨酸“+”，其他糖和醇皆“-”。与其他菌属的区别见表5—3—22。
4．埃希菌属从临床标本中常分离的是大肠埃希菌，靛基质“+”，甲基红“+”，枸橼酸“-”，但某些菌株动力“-”，迟缓发酵或禾发酵乳糖。不产气的菌株与志贺菌属的区别见表5—3—34（略）。出血性腹泻的大肠埃希菌，其中最常见的为Ο157：H7型，研究也较清楚。该菌种对山梨醇不分解(35℃24～48h)。最后用血清学诊断方法确定。
5．志贺菌属的鉴定：志贺菌属有4个种，临床上一般用抗血清鉴定血清群、型。在用诊断血清鉴定之前，必须确定属。有些大肠埃希菌生化特性不活泼，易与志贺菌混淆，根据表5—3—34所列的生化学特性鉴别。
4种志贺菌血清分群方法见有关产品说明。
6．沙门菌的鉴定：根据Bergey’s鉴定细菌学手册第九版(1994年)登载，沙门菌属分邦戈尔沙门菌(Salmonella bongori)和猪霍乱沙门菌(S．cho1eraesuis)。所有沙门菌属 (包括亚利桑那菌)血清型皆属上述二个种。邦戈尔沙门菌不到10个血清型，极其少见，而猪霍乱沙门菌有2 500以上血清型。
猪霍乱沙门菌再分6个亚种：亚利桑那亚种(subsp．arizonae)，猪霍乱亚种(subsp. choleraesuis)，双相亚利桑那亚种(subsp.diarizonae)，豪顿亚种(subsp. houtenae)，印第卡亚种(subsp. indica)，和萨拉姆亚种(subsp．salamae)。属于猪霍乱沙门菌猪霍乱亚种的血清型皆已被命名，而其他亚种血清型没有命名。其鉴别见表5—3—35。沙门菌的鉴定以抗血清凝集方法最方便。在凝集前必须确定属。与本菌相似的有枸橼酸杆菌和爱德华菌，可利用赖氨酸、靛基质、枸橼酸盐等试验进行区别。鉴别方法参见表5-3-32(略)。
沙门菌分型血清种类较多，依血清可将沙门菌分成2500个血清型。具体做法参见有关说明。
7．耶尔森菌的鉴定：耶尔森菌属中只有小肠结肠炎耶尔森菌较为常见。该菌与其他相应的菌属鉴定要点有二：①尿素酶阳性；② 37℃动力阴性，300℃以下培养动力阳‘哇。借此可以与其他的肠杆菌科细菌相区别。小肠结肠炎耶尔森菌的其他特性见表5-3-22。
二、试验方法
(一)硝酸盐还原试验
培养基：
蛋白胨 1g
硝酸钾 0.1g
蒸馏水 l00ml
将上述成分溶于蒸馏水，校正pH为7.4～ 7.6，分装，高压灭菌121℃15min，冷却后备用。
试剂：
A液：
对氨基苯磺酸 0.8g
5N醋酸 100ml
B液：
α-萘胺 0.5g
5N醋酸 l00ml
方法：将待检菌接种硝酸盐培养基中，孵育过夜，加入等量A、B液1～3滴，观察结果。
结果：红色为“+”，即还原硝酸盐。
注意点：
1．培养基不应含亚硝酸盐，以避免假阳性。
2．某些肠杆菌还原硝酸盐的能力很强，还原硝酸盐为亚硝酸盐后，进一步将亚硝酸盐分解为氨、氮、氧化氮，造成假阴性。所以，观察结果时，如无红色出现，应加少量锌粉，仍无色，说明亚硝酸盐进一步分解，硝酸盐反应为阳性。若加锌粉后出现红色，说明锌使硝酸盐还原为亚硝酸盐，而待检菌无还原硝酸盐的能力，即硝酸盐还原试验阴性。
(二)甲基红试验
培养基：
葡萄糖 0.5g
多价蛋白胨 0.5g
磷酸氢二钾 0.5g
蒸馏水 100ml
将上述成分溶于蒸馏水，校更pH为 7.2，分装，高压灭菌121℃10min，冷却备用。
试剂：甲基红 0.1g溶于95％乙醇 300ml，然后加蒸馏水至500ml。
方法：将待检菌接种于葡萄糖蛋白胨水中，孵育过夜，加甲基红试剂1～2滴，观察结果。
结果：红色为阳性，桔黄色为阴性。
(三)MIU培养基(动力-靛基质-尿素)
培养基：
胰蛋白胨 1g
NaCl 0.75g
磷酸氢二钾 0.2g
葡萄糖 0.1g
琼脂 0.4g
蒸馏水 l00ml
0.4％酚红 适量
20％尿素 10ml
将上述成分(尿素除外)溶于蒸馏水，加适量0.4％酚红，高压灭菌116℃20min，20％尿素过滤除菌，加入灭菌后的培养基中，分装、备用。
方法：将待检菌穿刺接种于MIU培养基中，孵育过夜，观察结果。
结果： 动力“十”，穿刺线周围扩散生长。
培养基变红为尿素阳性。
加靛基质试剂变红为吲哚阳性。
(四)拘橼酸盐试验(Simmons法)
培养基：
氯化钠 5g
硫酸镁 0.2g
磷酸二氢铵 1g
磷酸氢二钾 1g
枸橼酸钠 2g
蒸馏水 1000ml
0.2％溴麝香草酚蓝 40ml
将上述成分溶于蒸馏水，校正pH7.0，加溴麝香草酚蓝指示剂，高压灭菌121℃ 15min，分装，备用。
方法：将待检菌接种于培养基中，孵育过夜，观察结果。
结果：有细菌生长培养基变蓝色为阳性，无颜色改变为阴性。
(五)氨基酸脱羧试验
培养基：
蛋白胨 5g
酵母浸膏 3g
葡萄糖 1g
溴甲酚紫(1.6％溶液) lml
蒸馏水 1000ml
L—氨基酸 0.5％
将上述成分(除氨基酸外)溶于蒸馏水，然后加氨基酸，校正pH6.7～6.8，分装，高压灭菌121℃lOmin，备用。用于对照的不加氨基酸。
方法：取待检菌接种于氨基酸脱羧培养基和对照管中，封石腊油，35℃培养过夜，观察结果。
结果：培养基变紫色为阳性，黄色为阴性。对照管应保持黄色。
注意点：
1．培养基的pH值很重要。
2．加封石腊油造成厌氧环境。因为在厌氧情况下氨基酸脱羧生成的胺才稳定。
3．对照管如不呈黄色，则氨基酸脱羧酶试验不能作出判定。
(六)葡萄糖酸盐试验
培养基：
蛋白胨 1.5g
酵母浸膏 1g
磷酸氢二钾 1g
葡萄糖酸钾 40g
蒸馏水 1000ml
上述成分溶解、过滤，校值更pH6.5，分装每管lml，高压灭菌115℃15min，冷却，备用。
试剂：班氏试剂。
大量接种待检菌于培养基中，35℃孵育过夜或至48h，加班氏试剂，水浴中煮沸 lOmin观察结果。
结果：有黄色到橙色出现为“+”，没有颜色变化为“一”。
(七)糖、醇发酵试验
培养基：
蛋白胨 l0g
肉膏 3g
氯化钠 5g
Andrade指示剂 l0ml
蒸馏水 1000ml
将上述成分溶于蒸馏水，加糖或醇，校正 pH7.1～7.2，分装，高压灭菌121℃15min。冷却备用。
葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇的浓度为 1％。其他糖类和卫矛醇、水杨苷等的浓度为 0.5％。
乳糖、蔗糖和阿拉伯糖、木糖、鼠李糖等二糖应过滤除菌，再加入于已灭菌的基础液中。
Andrade指示剂：
蒸馏水 l00ml
酸性复红 0.5g
lmol／L氢氧化钠 16ml
将复红溶解于蒸馏水，加入氢氧化钠，数小时后，如复红褪色不够，再加l～2ml氢氧化钠，使呈淡黄色。
方法：接种待检菌，35℃孵育过夜，观察。
结果：培养基变红色为阳性，不变色或黄色为阴性。
(八)苯丙氨酸脱氨试验
培养基：
DL-苯丙氨酸 2g (L-型1g)
酵母浸膏 3g
氯化钠 5g
磷酸氢二钠 1g
蒸馏水 1000ml
将上述成分溶于蒸馏水，分装，高压灭菌 121℃15min，冷却，备用。
试剂：10％三氯化铁溶液。
方法：将待检菌接种于培养基，35℃孵育过夜，加三氯化铁试剂，观察结果。
结果：培养基变绿色为阳性，不变色为阴性。
弧菌属
一、常规鉴定
虽然弧菌属内包含的菌种较多，但临床实验室常见到12个菌种，其中具有明确致病作用的有霍乱弧菌、副溶血弧菌、河弧菌、拟态弧菌等。各种弧菌的鉴别特征见表5—3—36。
弧菌的鉴定分两步，首先应与相近的菌属区别，定属后再做种的鉴定。
1. 与相似的菌属区别：弧菌属归弧菌科。同科中还有气单胞菌属和邻单胞菌属，均为氧化酶阳性，发酵型。弧菌属与其两者的区别可依嗜盐性、甘露醇、氨基酸及Ο/129(2,4-二氨基-6,7-二异丙基碟啶)敏感性等加以区别，参见表5—3—36（略）。Ο/129试验用纸片浓度10μg、150μg二种，与纸片法药敏试验相同，出现抑菌环即判阳性(S)。
2．霍乱弧菌的鉴定：目前我国临床细菌室对霍乱弧菌的鉴定一般只作初步鉴定，具体方法如下：
(1)直接涂片
悬滴检查：取患者粪便制成悬滴标本(亦可用压滴法)，检查细菌的动力。霍乱弧菌无论是古典生物型或El-tor生物型均呈现极活泼的穿梭状运动。Ο1群霍乱多价血清制动试验阳性，可作早期推测性报告。
染色检查：取米泔样粪便的絮状物、粘液部分涂片2张，干燥后用乙醇固定，分别用革兰染色及1:10稀释的石炭酸复红染色，干燥后用油镜检查，观察有无革兰阴性、呈鱼群样排列的弧菌。涂片检查，只能对可疑患者作初步诊断参考，不能作确诊依据。
(2)玻片凝集试验：自分离平板上挑取可疑菌与霍乱多价诊断血清(即Ο1群霍乱多价血清)做玻片凝集试验，所用血清的效价应在1：80～l：160之间，如过浓，则稀释后再作凝集。将稀释血清滴加在洁净的载玻片上，挑取可疑菌落混于血清内，即刻(一般不超过 10s)出现肉眼可见的明显凝集者为阳性。菌落应以生理盐水作对照，对照应不发生凝集。为了提高阳性检出率，应多挑可疑菌落进行玻片凝集试验。作初步鉴定试验后，将此高度疑似菌送卫生防疫站作最后鉴定。
霍乱弧菌是重要病原菌。由于病原学及流行病学方面的需要，对Ο1群霍乱弧菌进一步分型是必要的。国际上公认通用的区分方法有两种：①生物分型；②抗原分型。
生物分型：根据霍乱弧菌在生物学上的差异，分为两个生物型，命名为古典生物型和 El-tor生物型。古典生物型的毒力往往大于 El-tor生物型。古典生物型菌株的染色体上带有两个毒素基因，而绝大多数El-tor生物型菌株仅有一个毒素基因。在霍乱病的防治中，对菌株进行生物分型是必要的。
两种生物型的区分方法见表5-3-38。
表5-3-38 霍乱弧菌的生物分型
生物学特性 生物型
古典型 El-tor型
V-P试验 - +
溶血性 - +
50U多粘菌素B纸片 S R
鸡血球凝集 - +
抗原分型：霍乱弧菌的血清学分型是依据菌体抗原。古典生物型和El-tor生物型的抗原同属Ο1群霍乱弧菌。
Ο1群的霍乱弧菌还可以进一步分血清型。依菌株是否具备A、B因子，分为小川、稻叶、彦岛3个型别，血清分型见表5—3—39(略)。
根据以上分型原理，鉴定致病性霍乱弧菌应遵循以下3个步骤：
① 可疑菌落与Ο1群抗血清凝集，确定是属于Ο1群，还是非Ο1群弧菌。
② 与分型血清A、B凝集，确定血清型。
③ 作生化试验进行生物分型，确定是古典生物型，还是El-tor生物型。
3．其他弧菌的鉴定：弧菌属中除Ο1群霍乱弧菌多次暴发世界性流行霍乱病，非Ο1群中的Ο139群最近报告暴发霍乱流行。其他弧菌种，不仅与腹泻有关，尚可引起肠外感染。分离出上述菌株应予以鉴定。本菌属中致病的12个菌种其生物学特性参照表5—3—37（略）所列及表5—3—40（略）分群鉴定。
鉴定中用0％NaCI生长、氧化酶、硝酸盐、氨基酸及发酵肌醇等几个试验将上述12个菌种分成6个群。分群后，仅1群、5群和6群还需要继续区分。
霍乱弧菌与拟态弧菌的区别方法可以用蔗糖发酵试验，前者阳性而后者阴性(表5—3—37)。
第5群3个菌种的区别可依据甘露醇发酵和葡萄糖产气试验，3种细菌的反应特征见表5—3—37。
第6群的4个菌种的区别可依据水杨苷和蔗糖发酵试验，4种细菌的反应特征见表5—3—37。
1992年10月发生在印度南方泰米尔纳依邦(Tamilmadu)的Madas，分离到与Ο1群霍乱弧菌无关、命名为Ο139型霍乱弧菌，该菌的生物学特性符合霍乱弧菌，用Ο1群霍乱弧菌抗血清不能制动，绵羊RBC溶血反应不定，抗多粘菌素B(50U)和复方新诺明，抗Ο/129，对MukherjeeⅣ和V型噬菌体不敏感。血清学鉴定参照卫生部生物制品检定所生产Ο139霍乱弧菌诊断用试剂盒说明书。
二、试验方法
见肠杆菌科鉴定，其中氨基酸脱羧酶试验培养基中必需含1％氯化钠。
Ο/129敏感试验：用含0.5％NaCl M-H琼脂，如纸片法药敏试验相同接种被检菌株，贴上含Ο/129 10μg／片、150μg／片，35℃孵育18h，记录结果：
150μg／片 10μg／片 结果
有抑菌环 有抑菌环 S
有抑菌环 无抑菌环 S／R
无抑菌环 无抑菌环 R
气单胞菌属
一、常规鉴定
本菌属鉴定，首先应和肠杆菌科细菌以及假单胞菌相区别，然后和弧菌科的其他菌属区别。
1．与肠杆菌科及非发酵菌区别：本属菌种氧化酶阳性，可发酵葡萄糖，依此与氧化酶阴性的肠杆菌科和不发酵葡萄糖的非发酵菌相区别。
2．与弧菌科其他菌属区别：本菌与弧菌属、邻单胞菌属的鉴别，可依高盐培养基上是否生长、分解甘露醇及O／129的敏感来区别，详见弧菌属鉴定。
3．气单胞菌的鉴定：利用细菌分解七叶苷、阿拉伯糖、水杨苷、产气等几项试验可将已知在临床标本出现的气单胞菌菌种分开 (见表5—3—41)。鉴定的双岐索引见图5—3—2。
二、试验方法
见肠杆菌科。
邻单胞菌属
常规鉴定
本菌须与肠杆菌科、非发酵菌及弧菌科其他菌属相鉴别。
1．根据氧化酶阳性和发酵葡萄糖与肠杆菌科和非发酵菌区别。
2．依嗜盐性，精氨酸、甘露醇试验与弧菌属及气单胞菌属区别。
3．本菌属仅有1个菌种，当与其他菌属鉴别后即可定种。类志贺邻单胞菌的1个较显著的特点是赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸及肌醇试验都阳性。
假单胞菌属
一、常规鉴定
从临床标本中分离到的非发酵菌，大约占所有革兰阴性杆菌中的15％，其中铜绿假单胞菌占70％，其次是不动杆菌属，嗜麦芽黄单胞菌占第三位，荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、洋葱假单胞菌、斯氏假单胞菌较少见。假鼻疽假单胞菌、鼻疽假单胞菌是罕见的。
1．荧光假单胞菌DNA同源群的鉴定：该群有3个菌种，铜绿、荧光和恶臭假单胞菌，主要生物学特性是能产生水溶性色素，如青脓素(pyoverdin)或称荧光素，绿脓素(pyocyania)不发荧光，可用氯仿从培养液抽提获得。此外，尚有少数菌株可产生红脓素(pyorubin)、黑脓素(pyomelanin)，也有不产色素的菌株。氧化酶阳性、精氨酸双水解酶阳性，一般能在麦康凯琼脂上生长，利用枸橼酸盐，对多粘菌素敏感。氧化葡萄糖、蔗糖无反应。
据统计，临床标本中铜绿假单胞菌不产绿脓素的菌株约占10％，既不产生绿脓素亦不产生青脓素的也占10％左右。据Gilardi报道，对于不产生绿脓素的铜绿假单胞鉴定最低限度应具有以下特性：端极一根鞭毛，有动力，在O-F葡萄糖培养基需氧管中产酸，氧化酶阳性，精氨酸双水解酶阳性，42℃生长，其他如硝酸盐还原产生氮气，麦康凯琼脂上生长，对多粘菌素敏感皆有鉴定参考价值。
rRNA同源群I、Ⅳ、Ⅱ菌种鉴定参照表 5-3-44、表5-3-45所示进行。
2．rRNA同源群Ⅲ，食酸假单胞DNA同源群菌种，根据DeVos和Tamaoka等的提议重新分类，归丛毛单胞菌属(Comanionas)，命名为食酸丛毛单胞菌(C.acidovorans)，睾丸酮丛毛单胞菌(C. testosteroni)和土生丛毛单胞菌(C. terrigena)。他们的鉴别见表5-3-46。
3．原属rRNA同源群V嗜麦芽假单胞一黄单胞菌群，现命名为嗜麦芽黄单胞菌 (Xanthomonas maltophilia)，在临床标本中较为多见。该菌在血液琼脂或麦康凯琼脂培养基上生长迅速，SS琼脂受抑制，血液琼脂生长菌落呈淡黄或棕色，有氨气味，不溶血，但在菌落周围变成绿色。克氏双糖铁琼脂上不产酸、不产生硫化氢。通常氧化酶试验阴性 (注意做该菌氧化酶试验应从M-H琼脂上刮取菌落)，但有极少数菌株产生弱的阳性反应。在O-F基础培养基上氧化麦芽糖比葡萄糖迅速而明显。该属中唯有嗜麦芽和洋葱假单胞菌是产生赖氨酸脱羧酶的菌种。其他如明胶酶、DNA酶、β半乳糖苷酶、水解七叶苷皆阳性。
4．原未确定RNA同源群腐败假单胞菌现在命名为腐败谢瓦纳拉菌Shewanella putrefhciens。该菌有3个生物变种。Owen等认为：生物变种1系来自环境，生物变种2大多数来自人类临床标本。
该菌为严格需氧性代谢，在克氏双糖铁琼脂高层，斜面皆不产酸，而产生大量H2S。这些黑色沉淀物掩盖培养基的显色(红色)反应，易与产生H2S的肠杆菌相混淆。在琼脂平板上集落棕黄到粉红色，轻度粘性和粘液状，氧化葡萄糖，但产酸微弱或延迟多日才出现，鸟氨酸脱羧酶和DNA酶阳性，大多数菌株最适生长温度为30”C。3个生物变种鉴定特性的最低限度见表5-3-47。
假单胞菌与相关菌种鉴定流程供实际工作中参考(见图5-3-4略)。
二、试验方法
(一) 氧化酶
纸片法最方便，试剂易保存
材料：直径6mm左右新华定性滤纸片；1％盐酸四甲基对苯二胺水溶液。
制法：将滤纸片在药物溶液中浸泡约 5min，取出，置35℃温箱中烘干。防潮保存。
用法：用镊子取氧化酶纸片1张，印刮平板上的菌落，10s内观察颜色变化，变紫黑色为阳性，不变为阴性。
对照：
阳性菌株：铜绿假单胞菌ATCC27853
阴性菌株：大肠埃希菌ATCC25922
(二) Hugh-Leifson氧化发酵(O-F)培养基
成分：
蛋白胨 2g
NaCl 5g
K2HPO4 0.3g
溴麝香草酚蓝 0.08g
琼脂 2g
碳水化合物 10.0g
蒸馏水 1000m1
pH 6.8土0.2
制备：按处方配制，准确校正pH，加入指示剂后培养基为绿色。分别再加葡萄糖、麦芽糖、木糖、阿拉伯糖等之后，培养基pH会降低，应重新校正。118℃ 15min灭菌后，分装高层试管，高度不应低于4cm。
用法：穿刺接种，35℃培养。高层上半部分变黄，为氧化型产酸；整个培养基变黄，为发酵型产酸；不变或变蓝为阴性。
质量控制：
氧化型菌株：铜绿假单胞菌ATCC27853
发酵型菌株：大肠埃希菌ATCC25922
阴性菌株：粪产碱杆菌
(三) 鞭毛染色
改良Ryu法，参见第一章第三节。
(四)乙酰胺酶试验
成分：
酵母浸膏 0.5g
葡萄糖 0.2g
氯化钠 5g
磷酸氢二钾 1g
乙酰胺 3g
琼脂 15g
蒸馏水 1000ml
0.02％酚红水溶液 4ml
pH 6.3
制备：上述试剂，加热熔解，调整pH，再加指示剂后，分装试管，高压灭菌，放斜面备用。
结果判断：变红为阳性，不变为阴性；或加奈氏试剂后出现黄色沉淀为阳性。
不动杆菌属
一、常规鉴定
本菌氧化酶阴性，动力阴性，球杆菌很容易与其他的非发酵菌区别。与肠杆菌科区别可利用硝酸盐试验，本菌阴性。
本属6个种的鉴别，可参考表5-3-48(略)。
产碱杆菌属
一、常规鉴定
凡具有周身鞭毛、有动力，氧化酶、触酶阳性，在O-F基础培养基上不分解任何糖类，不产生脲酶，不液化明胶、苯丙氨酸脱氨酶，精氨酸双水解酶皆阴性，应被鉴定为不分群糖类的产碱杆菌属菌种。而符合上述某些特性，但在O-F基础培养基中氧化葡萄糖、木糖，还原硝酸盐和亚硝酸盐，枸橼酸盐阳性，能在42℃生长，Cetrimide琼脂上生长，鉴定为木糖氧化产碱杆菌木糖氧化亚种。此菌与放射土壤杆菌的鉴别是乳糖、麦芽糖、甘露醇、水解七叶苷、脲酶试验前者全部阴性。
粪产碱杆菌的特点是有芳香味，菌落呈α溶血，边缘呈弥散状。
消化球菌属和消化链球菌属
一、常规鉴定
1．菌落：经48h培养，在血乎板上形成灰白、不透明、边缘整齐、凸起的小菌落，不溶血。
黑色消化球菌在血平板上可形成黑色菌落。
2．镜检：革兰㈠性圆形或卵圆形。消化球菌可呈散在不规则排列，消化链球菌可成双、成链排列。
大消化链球菌和微小消化链球菌生化反应相似，可以借形态来区分，前者菌体大，后者小。
3．生化鉴定及气相色谱分析：见表5-3-53(略)。表中还列出了各种细菌产生有机酸的特点。
念珠菌属
一、常规鉴定
念珠菌与酵母菌，二者菌落形态很相像，易造成混淆。生长在玉米-吐温80培养基的念珠菌可产生假菌丝，镜下观察即可与酵母菌区分开。
在鉴定念珠菌属时，假菌丝中隔处连接芽生胞子，为其重要特征，亦是与球拟酵母菌、地丝菌属的鉴别。
各种念珠菌的鉴别一般可用TTC还原反应、厚膜孢子、是否表面生长以及糖发酵、糖同化试验相区别。在这些试验中，TTC还原反应是念珠菌初步鉴定的最好方法。热带念珠菌反应最强，形成紫红色的菌落；白色念珠菌几乎无反应或反应很弱，形成白色菌落，其他念珠菌反应界于二者之间，呈现红色菌落。白色念珠菌厚膜孢子为阳性，热带念珠菌有时可见极少泪滴状厚膜孢子。液体培养基表面生长只有热带念珠菌、克柔氏念珠菌，二者间可用糖发酵鉴别。
二、试验方法
(一)放线菌酮-氯霉素琼脂培养基
成分：葡萄糖 40g
蛋白胨 l0g
琼 脂 17～20g
蒸馏水 1000ml
氯霉素 50.0mg (溶于10ml的95％酒精中)
放线菌酮 500mg (溶于10ml丙酮中)
配制：上述前4项成分溶于蒸馏水，高压灭菌121C 10min后，加入氯霉素酒精液和放线菌酮丙酮液，分装、备用。
(二)玉米-吐温80琼脂
培养基：玉米粉 l0g
琼 脂 10～20g
吐温80 10g
蒸馏水 1000ml
将玉米粉加水隔水煮沸30min(加热中不停摇震，以防玉米粉沉淀)，纱布滤过，取上清液，然后加入其他成分，补足水分，高压 121℃ 15min灭菌，备用。
方法：先将培养基加热溶化，取适量置于洁净的载物玻片上，把待检菌株水平方向穿刺接种。置潮湿平皿内，室温孵育24～72h，显微镜下观察厚膜孢子及假菌丝。
(三)糖发酵试验
酵母样菌发酵碳水化合物，产生二氧化碳和酒精，全部试验管中应放入倒管，以捕捉气体，能见到气体产生，才确认是发酵。凡是发酵碳水化合物都是同化，但所有同化未必皆发酵。
培养基：胰蛋白胨 2g
NaCl 0.5g
蒸馏水 l00ml
0.4％溴麝香草酚蓝 1.2ml
糖含量 2％
上述成分溶于蒸馏水，116℃ 15min高压灭菌，分装备用。
(四)糖同化试验
培养基：
硫酸铵 5g
磷酸二氢钾 1g
结晶硫酸镁 0.5g
酵母浸膏 0.5g
琼脂 20g
蒸馏水 1000ml
上述成分溶于蒸馏水，116℃ 15min高压灭菌，分装备用。
方法：融化20ml上述含氮基础培养基 (糖同化试验培养基)，冷至48℃，将培养24～72h被鉴定酵母菌株，混悬于4ml无菌盐水中，调整浊度相当于McFarland 4号管，全部菌液加入培养基中，混匀倾注成平板，凝固后，将含各种碳水化合物纸片贴在乎板表面，孵育于25～30℃，10—24h，检查被检菌在纸片周围生长与否，如观察不清楚，可继续孵育 24h。
(五)芽管形成试验
芽管试验是一种价值大又简单的快速推断性鉴定白色念珠菌方法。
方法：
1．玻片法：在载物玻片上加1滴血清，接种少量被检菌，盖上盖片，放于湿润平皿内，置35℃孵箱中，每隔1h检查1次，共检查3～4次。
2．试管法：用无菌试管，加血清0.2ml，接种被检菌，混匀后置37℃水浴箱中，每隔1h，用白金耳取出含菌血清，置于载玻片上进行镜检。
3．毛细吸管法：含有0.5ml小牛血清的毛细吸管，沾取鉴定菌落部分，乳化混匀，该毛细管置于试管中，35℃孵育2～4h，取出1滴，置显微镜下检测。
实验注意问题：有许多材料皆可用于芽管试验，如鸡蛋白、小牛血清、兔血清、羊血清及血库中血清，但在许多实验室始终认为小牛血清最好，它可以解除潜在的白色念珠菌的抗体、肝炎病毒和AIDS病毒问题。
值得注意的是，芽管和芽生孢子出芽，两者区别在于白色念珠菌产生芽管和芽生孢于连接处，不出现收缩现象，称为箭状；而其他念珠菌产生起始菌丝体和母体芽生孢子连接处呈紧缩现象。
上述试验必须用白色念珠菌、热带念珠菌、光滑球拟酵母菌做质量控制。试验孵育时间，不超过4h，因为其他产生假菌丝的念珠菌在上述时间之后开始发芽，出现起始菌丝体。
抗生素敏感试验
琼脂扩散法敏感试验(改良Kirby-Bauer法)
若只根据是否出现抑菌环而不考虑抑菌环的直径大小，来判断细菌是否对抗菌药物敏感的实验方法，其结果是不正确的。而纸片扩散法试验是应用标准的方法学原理，根据抑菌环直径大小与最低抑菌浓度的相关性，结合临床上已知敏感或耐药菌株的状态，其结果是可靠的。WHO推荐K-B法，其目的在于技术的简单和可重复性。本法特别适用于肠杆菌科细菌，也可用于快速生长的致病菌，但不适用于其他细菌，如嗜血杆菌、奈瑟菌、专性厌氧菌及酵母样菌等。无论用哪种方法接种，只要质控菌株的抑菌环在预期范围内，均可按同一解释标准报告结果。但并非从感染患者分离到的微生物都必须做敏感试验，对于污染、机体共生的正常细菌群和那些与感染无关的细菌，可不必做敏感试验，只有那些被认为引起感染的微生物，应先分纯、鉴定菌种后再做敏感试验。
一、试验用材料
(一)培养基
Kirby-Bauer法指定用Mueller-Hinton琼脂。多年大量的有关敏感试验的方法学研究，均采用该培养基，维持细菌正常发育，绝大多数细菌在此培养基上生长良好。此培养基不拮抗抗菌药物活性以及商品的批间差异等方面均优于其他培养基。若检测肺炎链球菌的敏感性时，在培养基中加5％的脱纤维羊血，制成血平板。测嗜血杆菌及淋病奈瑟菌的敏感性时，在培养基中须加入1％血红素和2.5mg/ml辅酶I后应校正pH 7.2～7.4。
制备MH琼脂平板应用直径90cm平皿。在水平的实验台上倾制。琼脂厚为4mm，允许误差为土lmm。琼脂凝固后，应测一下pH是否正确。琼脂于板应放4℃保存，在7日内用完。
(二)药物纸片
抗菌药物纸片直径约为6.00～6.35mm，每片的吸水量约20μl。采用K-B法，纸片的药物含量必须与该法规定的一致，不得任意更改。药物纸片可以购买，也可自制，用前必须做质量鉴定。用以下两个指标判定纸片的质量：
1．片间差：是衡量不同纸片含药是否均一的指标。测定方法：以质控菌株接种M-H琼脂平板，一块平板上贴6张相同的纸片。 35C过夜，培养后，记录6个抑菌直径，其最大和最小之差不应大于1～2mm。
2．准确度:判定纸片的实际含药量与标量是否一致。
纸片的合理保存十分重要。药物纸片必须在有干燥剂的容器内低温(-10℃以下)保存。只拿出少量放4℃备日常工作用。装纸片的容器从冰箱取出后，必须在室内温暖l0分钟以上才可打开。如立即打开，空气中的水分会冷凝在纸片上，容易潮解。
细菌实验室应按临床的需要，决定敏感试验抗菌药物的种类。同类抗菌药物仅选用一个代表。应根据测定细菌的属种选药。基本方案见表5-4-1。
(三)质控菌株
K—B法质量控制用菌株常规用：金黄色葡萄球菌ATCC 25923、大肠埃希菌ATCC 25922、铜绿假单胞菌ATCC 27853。测定 MH琼脂是否适合做磺胺类试验，须用粪链球菌ATCC 29212或33186。上述质控菌株应由卫生部临床检验中心供应。实验室保存菌株可用冻干法或保存在高层琼脂中。常规质量控制菌株应每月更换1次。
质控菌株简便保存方法：将新得到的冻干菌株接种含血的M-H平板复活。然后每株细菌接种10支高层琼脂管，放置冰箱保存。每月取1支，传种细菌供常规使用。待用剩至最后1支，再传代在M-H平板上，接种一批高层琼脂管备用。如此连续可避免原始菌种不接触抗生素，以防变异。
(四)菌液比浊管
为保证敏感试验的准确度和精密度，必须对接种菌液的浓度做相应控制。采用比浊的办法控制菌悬液浓度。接种菌液浓度为 1.5×l08／m1，浊度相当于麦氏标准比浊管第1号管的1／2。
比浊管配法如下：
0.048mol／L BaCl2 0.5ml
0.18mol／L H2SO4 99.5ml
将二液置冰水浴中冷却后混合，置螺口试管中，放室温暗处保存。用前混匀。有效期为6个月。
二、操作方法
1．制备接种菌液：临床标本中分离的细菌做药敏试验，应挑取已分纯的菌落4～5个制备菌悬液。
制备菌液的方法是挑选琼脂平板上、形态相同的菌落移种于M—H液体培养基中，置35℃水箱中孵育4小时，校正浊度，或用接种环挑取菌落，悬浮于生理盐水中，振荡混匀后与标准比浊管比浊，以有黑字的白纸为背景，调整浊度与比浊管相同。此法制备接种菌液适用于任何细菌。
2．接种平板：制备好的接种菌液必须在 15min内使用。用灭菌的棉拭子蘸取菌液；在管壁上旋转挤压几次，去掉过多的菌液。
用拭子涂布整个培养基表面，反复几次，每次将乎板旋转60°，最后沿平皿周边绕两圈，保证涂布均匀。
3．贴纸片：须待平板上的水分被琼脂完全吸收后再贴纸片。用镊子取纸片一张，贴在琼脂平板表面，用镊尖压一下，使其贴平，纸片一贴就不可再拿起，因纸片中的药物已扩散到琼脂中。每张纸片间距不少于24mm，纸片中心距平皿边缘不少于15mm。直径为 90mm的平板最好贴6张。
贴上纸片后，须在15min内放35℃孵箱培养。不可放在CO2环境中。
4．孵育：必须用35℃孵箱，平板在孵箱内最好单独摆放，不超过二个叠在一起，否则中间的平板，达不到孵箱温度而产生预扩散的作用，平板孵育18～24h后，读取结果。
5. 判定结果：培养后取出平板，测量抑菌环的直径。抑菌环的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。有的菌株可出现蔓延生长，进入抑菌环，磺胺药在抑菌环内会出现轻微生长，这些都不作为抑菌环的边缘。
按抑菌环直径判断细菌的敏感性，应依据表5-4-3所提供的解释标准，报告结果必须明确中介的含意，加以区别。
琼脂稀释法敏感试验
一、概 述
琼脂稀释法敏感试验是将不同剂量的抗菌药物，分别加于融化并冷至45℃的定量琼脂培养基中，混匀，倾注成无菌平板，即为含有药物浓度递减的培养基。接种幼龄菌于该培养基上，经培养后观察被检菌的生长情况，最低药物浓度抑制细菌生长者为该菌的最低抑菌浓度。其优点是：
1．比液体稀释法重复性好；
2．每个平板同时测定多株细菌；
3．可观察被检菌集落生长良好与否；
4．发现被污染的菌落；
5．可引用机械化手段，提高效率。
二、材料和试验方法
1．抗菌药物原液的配制：配制各种抗菌药物原液的溶剂及稀释剂见表5-4-4。
2．抗生素稀释步骤：见表5-4-5。
3．培养基的制备及贮存：培养基为MH琼脂，按厂家规定进行配制时加水量要减少 l／10，以备留给补充稀释好的抗生素用， 121℃15min灭菌，水浴中冷却至48～50℃；100mm平皿加一个浓度的抗生素2.5ml，再加入MH琼脂25ml(刻度烧杯量)，充分混匀。已配制含有抗生素琼脂平板，应放在塑料袋内，4～8℃中保存，用于质控试验平板，只能保存5天，常规试验时，略可延长使用时间。
4．接种方法：为获得准确的MIC结果，接种被检菌数量，必须控制在规定范围内，即每个斑点中应含104CFU。制备方法如下：挑选过夜琼脂上培养物4～5个菌落接种于4～5mi肉汤中(如M—H肉汤、脑心浸液肉汤等)。35℃培养至微混浊，再调节至0.5号麦氏管浓度(108 CFU／m1)。也可挑选过夜生长的琼脂上纯菌落，直接用盐水稀释比浊到 0.5号麦氏管浓度。再1：10稀释成为 107CFU／ml，30min内，将上述被检菌株悬液接种至含抗生素的一系列平板上。接种方法有多种，最好是用接种器，一次可接种大约 36个菌株，每根针约可传种2μl菌液。接种前平板必须相当干燥，操作时从最低浓度的琼脂平板种起。为了核对每个被验菌株的生长或污染状况，最后还需点种一个不含抗生素的对照平板；即将每株被检菌悬液，用定量加液器吸取1μl菌液，接种在1／2无抗生素的M-H琼脂平皿上，充分划线，第二日观察有否污染，菌落计数，菌数大约为104CFU／ml。
每次检测要用质控菌种跟随操作。
5．孵育：接种好的平板，放置室温让接种液被充分吸干后，置35，C温箱内16～20h读取结果。 特殊菌种的抗生素敏感试验所需要的条件见另节。
三、读取结果及报告
首先读质控平板的MIC，然后读取被检菌株测定的MIC值；在前后二个不同梯度浓度的抗生素M-H琼脂平板上，细菌生长数量有80～90％的突然减少为结果终点，即 MIC值。
有几点要注意的：① 薄雾状生长不算；② <5个菌落不算；③ 若在数个平板上呈拖尾或跳管生长等现象，应该重做。
MIC单位为μg/ml，根据MIC值参照表 5-4-3（略），报告相应的敏感或耐药结果，或同时将MIC值附在敏感或耐药后面。
在测定同时，可用表5-4-6（略）所列质控菌株检测MIC，以控制本次实验的准确性。
特殊菌的抗生素敏感试验
临床实验室常规敏感试验，除了检测容易生长在M-H培养基的需氧、兼性厌氧菌外，尚有许多不能在M-H培养基上生长或生长不良的菌株，如肺炎链球菌、流感嗜血杆菌及淋病奈瑟菌。培养基内必须补充特殊的营养成分。
一、肺炎链球菌药敏试验
近年来，耐青霉素的肺炎链球菌频率在上升，据美国报告高达20％，其中1～3％为高度耐药株(MIC≥2.0μg／m1)。
1．培养基：M-H琼脂加5％脱纤维羊血。
2．药敏纸片：NCCLS推荐用1μg／片苯唑西林，代替青霉素G做敏感试验，报告青霉素G结果。
3．操作方法：参照琼脂平板扩散法。
4．判定标准：详见表5—4—7所示。苯唑青霉素抑菌环小于19mm时，应作MIC测定。
5. 质控菌种用肺炎链球菌ATCC 49619。
二、流感嗜血杆菌药敏试验
(一)琼脂扩散法敏感试验
1．培养基：用HTM琼脂，配制方法是用含阳离子的M-H为基础培养基(参见第三节)，补充辅酶I(NAD)15μg/m1，牛血红素15μg/ml，酵母浸膏5mg/m1，胸腺嘧啶脱氧核苷磷酸化酶0.2IU／m1，pH7.2～7.4。
2．挑选从隔夜孵育(35℃、5～7％ CO2环境下)生长于巧克力琼脂平板上菌落，混悬于M-H肉汤中，调整浓度至0.5麦氏标准浊度管，用棉拭子浸菌液直接涂布在HTM琼脂平板表面(参照琼脂扩散法)，孵育于5～7％CO2环境下，35℃、16～18h，测量抑菌环直径大小，参照表5-4-8（略）标准解释。
3．质控菌种为流感嗜血杆菌ATCC 49247、ATCC 10211株。
(二)稀释法
用微量稀释法试验，全部操作用HTM肉汤，最后总容量为100μ1／每孔，试验菌种悬液制备，如同琼脂扩散法，先调整浓度为 0.5号麦氏标准浊度管，用HTM肉汤再稀释200倍，使该悬液浓度为5×105CFU／m1，被测菌株的接种，参照微量稀释法敏感试验。微孔板置35℃，需氧环境孵育20～24h后，观察结果。无菌生长孔为最低抑菌浓度。参照表5—4—8解释标准报告结果。用流感嗜血杆菌ATCC 49247株做质量控制。
(三)流感嗜血杆菌β内酰胺酶
可用硝基头孢噻吩试验方法检测，但有极少数菌株β内酰胺酶阴性而对氨苄西林耐药。
三、淋病奈瑟菌药敏试验
(一)纸片扩散法
1．培养基：加5％羊血的巧克力M-H琼脂，但只能用于检测已标准化的4种抗生素：青霉素、四环素、壮观霉素和头孢曲松。 NCCLS推荐用GC培养基加1％生长补充剂，因为该补充剂含有极少量胱氨酸，能灭活各种β内酰胺抗生素，诸如亚胺硫霉素、克拉维酸等。
生长补充剂由下列试剂配成：每升水含有1.1g L-胱氨酸，0.03g盐酸鸟嘌呤，3mg硫胺，13mg对-氨基苯甲酸，0.0lg维生素B12，0.1g羧化辅酶，0.25g NAD，1g腺嘌呤，10g L-谷氨酰胺，100g葡萄糖，0.02g 硝酸铁，该处方类似于Iso—Vitatex。
2．菌种准备：直接从过夜培养的巧克力琼脂上挑选菌落，混悬于肉汤中，调整浓度至0.5号麦氏标准比浊管，用棉拭直接涂布于含1％生长补充剂的GC平板上，贴好纸片后，置3～5％CO2环境下，35℃孵育20～24h。质控菌株是淋病奈瑟菌ATCC 49226。结果解释参照表5—4—9标准。
(二)琼脂稀释法
首选培养基是加有生长补充剂的GC脂。具体操作方法，参照第二节琼脂稀释法敏感试验。菌种准备，同纸片扩散法，接种菌液数量每个斑点是104CFU，应做空白对照，计数活菌数。平板置3～5％二氧化碳环境下，35℃，孵育20～24h，观察并报告结果。淋病奈瑟菌抑菌环直径及相关MIC值解释见表5-4-9(略)所示。
[附]：
一、耐甲氧西林葡萄球菌的检测
(一)纸片扩散法
纸片扩散法检出耐甲氧西林的葡萄球菌株是可靠方法之一。挑选来自过夜琼脂平板的培养物，制备被检菌株的悬液，调整至适当浓度，具体操作如常规纸片法药敏试验一样，贴苯唑青霉素(1μg/片)孵育35℃，整24h(不可延长)，小心挑选模糊生长的培养物，或在抑菌环内的菌落，这类微生物提示耐甲氧西林菌株。若检测凝固酶阴性葡萄球菌时，则孵育时间延长至48h。
(二)微量肉汤稀释法
为检测抗葡萄球菌的抗生素MICs，NCCLS最近推荐使用加有阳离子和补充2％NaCl的MHB培养基(M-H肉汤)，接种5×105／m1被检菌株悬液，孵育35℃，24h，用苯唑西林检测金黄色葡萄球菌，凝固酶阴性葡萄球菌也可选用甲氧西林检出异质性耐药菌株。
(三)琼脂筛选法
琼脂筛选是用M-H琼脂，补充4％NaCl和苯唑青霉素(6μg/m1)或甲氧西林(10μg/m1)倾注成平板，调整被检菌悬液为0.5号麦氏管浓度，用棉拭子浸沾菌悬液，涂于平板上，35℃整24h，检查平板中生长的菌落，甚至只有一个菌落，提示耐苯唑西林菌株。用于检出凝固酶阴性葡萄球菌时，孵育48h，增加敏感性。
二、β-内酰胺酶的检测
临床标本中分离金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌以及最近发现的肠球菌属少数菌株对青霉素、氨苄青霉素出现耐药。由于上述菌株产生 β-内酰胺酶水解前述抗生素。检测该酶有下列方法：
(一)微生物活性消失法
此法是以一株对青霉素高度敏感的枯草芽胞杆菌的指示菌，如待检菌株产生β内酰胺酶，破坏了青霉素，则在划线两边有枯草芽胞菌生长，否则指示菌仍呈很大抑菌环。具体操作结果解释参照《微生物学和微生物学检验》第115页，刘恭植主编，人民卫生出版社，1988年。
(二)淀粉-碘测定法
β内酰胺酶破坏β内酰胺环，碘与被打开β内酰胺环结合，使蓝色的淀粉-碘复合物转变成无色。
方法：用pH6.0磷酸缓冲液配制青霉素悬液 6000μg/ml，取该液0.1 ml置于微量稀释板凹孔中，挑选检测菌株数个菌落混悬于其中，摇动30min，静置室温中1h，加淀粉液2滴，再加碘液1滴，混合，立即观察颜色变化，阳性者当加入碘液后，首先立即出现蓝色、如在10min内消失蓝色，提示该菌产生β-内酰胺酶。
(三)酸测量法
青霉素被β-内酶胺酶水解后成青霉素酸，pH值下降6.8以下，用酚红指示剂，由红(紫)色 (原液：枸橼酸缓冲液pH8.5) → 黄色(pH6.8以下)。
(四)头孢硝基噻吩显色反应
头孢硝基噻吩(Nitrocefin)的β-内酰胺环被β-内酰胺酶打开，基质由黄色变成红色。
液体方法：10mg头孢硝基噻吩溶解于lml的二甲基亚砜中，然后用0.1mol/L PBS(pH7.0)再稀释 1：20，最后浓度为500μg／m1，溶液呈黄或淡橙色，保存4～10℃，可用几个星期。取该溶液0.05ml置放于微量稀释板凹孔中或小试管中，挑取被试菌落，制成浓厚悬液，与凹孔中基质液混和，室温10～ 30min，头孢硝基噻吩由黄变成红色为阳性，若显色不明显，观察可延长6h。
有报道纸片法用于流感嗜血杆菌和淋病奈瑟菌检测β-内酰胺酶的结果是准确的，但对于某些菌株产生少量而与菌细胞紧密结合的β-内酰胺酶，如腐生葡萄球菌等，用液体法检测更好。上述任何一种检测方法都应用质量控制。
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