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【继续教育】16S rRNA 在微生物系统分子鉴定及分子检测中的应用  

2012-09-19 23:01:11|  分类: 网络资源 |  标签: |举报 |字号 订阅

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 1. 16S rRNA 同源性分析作为微生物系统分子分类鉴定的理论依据:

    传统的细菌系统分类的主要依据是形态特征和生理生化性状, 采取的主要方法是对细菌进行纯培养分离,然后从形态学、生理生化反应特征以及免疫学特性加以鉴定。本世纪60 年代开始, 分子遗传学和分子生物学技术的迅速发展使细菌分类学进入了分子生物学时代, 许多新技术和方法在细菌分类学中得到广泛应用。目前,rRNA 分子己成为一个分子指标广泛地用于各种微生物的遗传特征和分子差异的研究, 加上大量已知微生物的DNA 都被测定并输入国际基因数据库, 成为对微生物鉴定分类非常有用的参照系统, 从而可以通过对未知微生物DNA 序列的测定和比较分析, 达到对其进行快速、有效的鉴定分类的目的。
    核糖体的RNA 含有3 种类型: 23S、16S 和5S rRNA, 它们分别含有的核苷酸约2 900、1 540 和120 个。60年代末,Woese 开始采用寡核苷酸编目法对生物进行分类, 他通过比较各类生物细胞的核糖体RNA (rRNA )特征序列, 认为16S rRNA 及其类似的 rRNA 基因序列作为生物系统发育指标最为合适。其主要依据是: 它们为细胞所共有, 其功能同源且最为古老, 既含有保守序列又含可变序列, 分子大小适合操作: 它的序列变化与进
化距离相适应。5S rRNA 虽易分析, 但由于核苷酸少, 没有足够的遗传信息用于分类研究。而23S rRNA 含有的核苷酸数几乎是16S rRNA 的两倍, 分析较困难。16S rRNA 的相对分子量适中, 作为研究对象较理想。

    细胞核糖体RNA 可将遗传信息得以表达, 转译成蛋白质, 因此可以想象这些分子具有作为种系发生的指示所必不可少的性质。在相当长的进化过程中, rRNA 分子的功能几乎保持恒定, 而且其分子排列顺序有些部位变化非常缓慢, 以致保留了古老祖先的一些序列。也就是说, 从这种排列顺序可以检测出种系发生上的深远关系。rRNA 结构既具有保守性, 又具有高变性。保守性能够反映生物物种的亲缘关系, 为系统发育重建提供线
索; 高变性则能揭示出生物物种的特征核酸序列, 是属种鉴定的分子基础。而且 rRNA 在细胞中含量大, 一个典型的细菌中含有10 000~ 20 000 个核糖体, 易于提取, 可以获得足够的使用量供比较研究之用。选用的PCR 扩增引物及测序引物对应的序列是 16S rRNA 中高度保守的序列, 其中PCR 引物 8~ 27 位的 16(+ ) 和 1 512~ 1 492 位的 16(- ) 扩增分离物的 16S rRNA 全基因, 选择位于 8~ 27 位的 16(+ )、683~702N3R 和1512~ 1492 位的16(- )保守序列作为测序引物, 可准确测定16S rDNA 的一部分序列。根据核糖体16S rRNA 结构变化规律, 在所测定的区域中包括了V1、V2、V3 和V4 4 个高变区, 尤其是V2 这一高变区, 由于进化速度相对较快, 其中所包含的信息, 足够用于物种属及属以上分类单位的比较分析。因此, 测定 16S rDNA 部分序列即可达到对分离物的分子鉴定的目的。

2. 16S rRNA 序列分析的基本原理和技术步骤

    通过比较各类生物 16S rRNA 的基因序列, 从序列差异计算它们之间的进化距离, 可以绘出生物进化树。因此, 16S rRNA 序列分析技术的基本原理就是从微生物样本中的 16S rRNA 的基因片段, 通过克隆、测序或酶切、探针杂交获得 16S rRNA 序列信息, 再与 16S rRNA 数据库中的序列数据或其他数据进行比较, 确定其在进化树中位置, 从而鉴定样本中可能存在的微生物种类。其技术主要包括以下3 个步骤。

1)基因组DNA 的获得

    首先从微生物样品中直接提取总DNA, 对易于培养的微生物可通过培养富集后再进行提取。另一种选择是提取微生物细胞中的核糖体RNA。一个典型的细菌含有10 000~ 20 000 个核糖体, 而基因组DNA 中rrn 操纵子(即 rDNA 序列)的拷贝数相对较少(原核生物一般为 1~ 10 个左右), 因此 rRNA 在细胞中的含量很高,易于获得较多的模板, 但是RNA 易于降解,RNA 的提取技术相对于DNA 的提取较为复杂, 一般研究多采用提取细胞总DNA, 但也可根据情况选择提取rRNA。由于rRNA 在死亡的细胞中很快降解, 提取rRNA 通过反转录钓取16S rDNA 序列的方法能够区分被检测的细胞是否为活体细胞。

2)16S rRNA 基因片段的获得

    过去常常将提取的总DNA 经酶切后克隆到λ噬菌体中建立DNA 库, 进一步通过16S rRNA 通用探针进行杂交, 筛选含有16S rDNA 序列的克隆(鸟枪法)。由于PCR 技术的产生和发展, 现在一般采用16S rRNA 引物PCR 扩增总DNA 中的rRNA 序列, 或通过反转录PCR 获得CrDNA 序列后再进行分析。采用PCR 技术的优点在于不仅一次性从混合DNA 或RNA 样品中扩增出16S rRNA 序列, 而且方便了后面的克隆和测序。但也同样会出现PCR 所固有的缺点, 尤其是采用16S rRNA 保守序列的通用引物对多种微生物混合样品进行扩增, 可能出现嵌合产物(Chimeric product)和扩增偏嗜性现象, 影响结果的分析。

3)通过 16S rRNA 基因片段分析对微生物进行分类鉴定

    16S rRNA 基因片段的分析方法主要包括以下3 种: 一是将PCR 产物克隆到质粒载体上进行测序, 与16SrRNA 数据库中的序列进行比较, 确定其在进化树中的位置, 从而鉴定样本中可能存在的微生物种类, 该方法获得的信息最全面, 但在样品成分复杂的情况下需要大量的测序工作。二是通过16S rRNA 种属特异性的探针与PCR 产物杂交以获得微生物组成信息。此外探针也可以直接与样品进行原位杂交检测, 通过原位杂交不仅可以测定微生物的形态特征和丰度, 而且能够分析它们的空间分布。该方法简单快速, 主要应用于快速检测, 但可能出现假阳性或假阴性结果。三是对PCR 产物进行限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism s,RFLP)分析, 通过观察酶切电泳图谱、数值分析, 确定微生物基因的核糖体型, 再同核糖体库中的数据进行比较分析样品中微生物组成或不同微生物的种属关系。

     目前国际上有许多核酸数据库能够检索核糖体核酸序列, 一些软件可用于序列对比分析和构建进化树, 如Clustalw 和TreeV iew 软件。此外一些研究机构还建立了专门用于核糖体序列分析的数据库, 其中最著名的是美国密歇根州立大学的RDP(RibosomalDatabase Project- II)库, 该数据库目前包括 9 700 多个小亚基单位 rRNA 序列, 用户可以通过匿名 FTP (ftp. cmG. m sM. edM ) 和www 网(http://www.cme. m su. edu/RDP/)使用这些数据和软件, 其中www 网提供的主要服务包括: 核糖体探针检测: 用户委托序列在 rMA 分类系统中的大致位置分析; 筛选可能的嵌合 rRNA 序列;自动序列对准比较; 提供未知序列在系统发育进化树中的位置以及RFLP 结果分析等多种功能(M adak 1999)。此外, 欧洲还有一些核糖体数据库, 如比利时安特卫普(Antwerp)大学建立的数据库提供6 000 多种小亚基单位序列(Van de Peer Y.  1997), 其网址为: http://rna. uia ac be /ssu/。德国幕尼黑技术大学的ARB(A rbor Tree Project)数据库(http://www.biol chem ie tum uenchen. de/pub/ARB/)提供自动序列对准比较, 二级结构检测和进化树构建等程序。

3.16S rRNA 寡核苷酸编目分析

     16S rRNA 寡核苷酸编目分析所依据的基本原理是用一种核糖核酸酶水解 rRNA, 可使其产生一系列寡核苷酸片段, 如果两种或两株微生物的亲缘关系越近, 则它们所产生的寡核苷酸片段的顺序也越接近, 反之亦然。

    实验的方法大体是: 将要鉴定菌株的 rRNA (一般事先用 P 进行标记)提纯, 再用可专一性水解G 上 3′端磷酸酯键的T1 核糖核酸酶进行水解, 产生以G 为结尾的长度不一的寡核苷酸片段, 接着将水解产物进行双向电泳, 用放射自显影技术获得16S rRNA 寡核苷酸的指纹图谱, 并确定不同长度寡核苷酸斑点在电泳图谱上的位置, 然后将图谱中链长在6 个核苷酸以上的寡核苷酸作顺序分析, 其结果按长度不同进行编目, 并列入表中。通过比较、计算和分析, 就可定量地知道各被测菌株间的亲缘关系。通过T1RNA 酶的水解, 一般可使 rRNA 形成含有1~ 20 个核苷酸单位的寡核苷酸片段。如果形象地把只含一个核苷酸的片段称为“字母”的话, 则含两个以上核苷酸的片段就成了“单词”。将含有6 个“字母”以上的所有“单词”双链测定其核苷酸序列, 最后可把它们编成一部“词典”。于是, 两个菌株 rRNA 的相似性就可通过查阅“词典”来作比较。比较和分析的具体方法有两种: 一种是计算它们间的相似系数或缔合系数; 另一种是序列印记法。


4.用 16S rRNA 研究微生物的系统进化关系用 16S rRNA 并结合限制性内切酶消化, 获得的限制性片段长度多态性资料已广泛用于亲缘关系分析
(Lauerre 1997;Brunel 1997; 潭志远 1998)。从70 年代开始,Woese 和他的同事们用16S rRNA 寡核苷酸序列分析技术对400 多株原核生物和真核生物进行分析。依据16S rRNA 序列绘制的生命进化树, 经过比较研究导致了古细菌界的建立。古细菌、真细菌和真核生物按相似系数各自成为一群, 它们之间的相似系数只有0.1左右,古细菌主要包括在极端条件下生长的甲烷细菌、极端嗜盐菌和嗜热嗜酸菌, 它们的细胞结构虽然与
真细菌相似, 但从生物化学和一些生物大分子结构上看, 它们与原核生物的差异并不亚于它们与真核生物的差异。因而Woese 等认为, 从系统发育来说, 它们既不属于原核生物, 也不属于真核生物, 从而构成了新的古细菌界, 即在生物进化史上不是原认为的两条进化路线的概念, 而是按三条进化路线, 分为古细菌、真细菌和真核生物三界进化而来。Woese 等(1991)基于进一步研究, 建议将上述三界提为更高的分类单位——(Domains)。
Woese 的三域理论逐渐得到认同并得到了基因组研究结果的支持, 1996 年詹氏产甲烷球菌(M ethanococcusjannackii)全部基因序列分析结果说明, 甲烷球菌不同于任何已知细菌, 表明了古生菌是一个独立的域。16S rRNA 序列分析作为微生物分类系统的主要依据已得到了广泛认同, 随着微生物核糖体数据库的日臻完善, 该技术将成为研究细菌系统进化的一个有力工具。
    16S rRNA 寡核昔酸序列分析法不仅发现和建立了古细菌界(域), 而且对一般真细菌之间的亲缘关系进行了比较深刻的揭示。Woese 等对大量的细菌和放线菌的菌株16S rRNA 寡核苷酸分析比较后, 将整个真细菌分为10 大组, 革兰氏阳性菌属其中一组, 或称为“门”。革兰氏阳性细菌门下又分为两个亚门: 一个亚门是以芽孢杆菌及其相近菌株为代表的低G 十C 含量(低于摩尔分数50%)的一类菌, 包括乳杆菌属、链球菌属、利斯特
氏菌属、环丝菌属、肉食杆菌属、肠球菌属、片球菌属、明串珠菌属等乳酸菌类群菌及梭状芽孢杆菌属等, 此外尚有枝原体属也归入此亚门; 另一亚门是G 十C 含量较高的革兰氏阳性菌。


5.结束语:由于 16S rRNA 序列的保守性和存在的普遍性, 以及核酸序列本身的稳定性, 序列分析的重现性极高, 基于当今分析技术的改进, 应用16S rRNA 作为分子指标, 可以实现快速、微量、准确简便的对微生物进行分类鉴定。分子分类正是在从研究的目的过度到研究的手段。随着分子分类的理论和方法的日趋成熟, 其已逐步成为微生物资源调查和环境生态研究的一种强有力工具。

 

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