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【转贴】大肠埃希菌的生物危害评估报告  

2010-11-03 22:35:33|  分类: 生物安全 |  标签: |举报 |字号 订阅

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一、大肠埃希菌的传播与致病

        埃希菌属包括多种细菌,临床上以大肠埃希菌最为常见。大肠埃希菌(E.coli)通称大肠杆菌,是所有哺乳动物大肠中的正常寄生菌,一方面能合成维生素B及K供机体吸收利用。另一方面能抑制腐败菌及病原菌和真菌的过度增殖。但当它们离开肠道的寄生部位,进入到机体其他部位时,能引起感染发病。有些菌型有致病性,引起肠道或尿路感染性疾患。

        大肠埃希菌所引起的食源性疾病主要由动物性食品引起,常见中毒食品为:各类熟肉制品、蛋及蛋制品、生牛奶及奶制品、汉堡包、乳酪,其次为蔬菜、水果、鲜榨果汁、饮料等。中毒原因主要是食品未经彻底加热,或加工过程中造成的交叉污染,老人及婴幼儿为易感人群。

        大肠埃希菌可以引起肠道外感染如泌尿系感染、菌血症、胆囊炎、肺炎及新生儿脑膜炎等,也会造成从轻微腹泻到霍乱样严重腹泻乃至引起致死性的并发症如溶血性尿毒综合征(HUS),根据其不同的血清型别、毒力和所致临床症状的不同,可以将导致腹泻的大肠埃希菌分为5类:(1)产肠毒性大肠杆菌(enterotoxigenic   E.coli,ETEC):是许多发展中国家儿童及旅游者腹泻常见病原菌,热带尤为常见。由食入污染食物和水而致病。本菌可产生大量耐热和非耐热肠毒素,患者腹泻呈水样便,伴有恶心、腹痛、发热等症。(2)肠致病性大肠杆菌(enteropathogenic E.coli,EPEC):可引起婴儿肠炎,夏季腹泻及婴儿霍乱。本菌具有很强传染性,可引起院内暴发流行,也可引起成人腹泻。传染源来自食品操作人员或粪便污染供水设施。(3)肠侵袭性大肠杆菌(enteroinvasive E.coli,EIEC):由人-人传染而致病(推测为粪-口途径)。因具有侵袭性,侵入人体肠粘膜上皮细胞后可迅速繁殖,破坏肠粘膜及其基底膜,出现粘膜溃疡,发病多呈散在性。与痢疾杆菌相似,引起痢疾样腹泻。(4)肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic E.coli,EHEC):可引起暴发或散在性出血性结肠炎。患者常出现中度高热、恶心、呕吐,痉挛性腹痛、腹泻,早期为水样便,患者出现贫血、血小板减少,少数出现急性肾功能衰竭,溶血性尿毒综合征。(5)肠粘附性大肠杆菌(enteroadherent E.coli,EAEC):是儿童持续性腹泻的病因之一。

二、大肠埃希菌的生物学特性

1、形态染色:为革兰氏阴性杆菌,有鞭毛,周身有菌毛。

2、培养特性 需氧或兼性厌氧。在普通培养基上生长良好,形成中等大小的光滑型菌落;在鉴别培养基上因分解乳糖产酸,使指示剂变色,菌落被着色;在SS、中国蓝及伊红美蓝平板上分别呈红色、蓝色及紫黑色,借此可与沙门菌及志贺菌相鉴别,但应注意少数菌株分解乳糖缓慢。

3、生化反应:本菌生化反应活泼,能分解葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇等多种糖类,(即IMViC反应++--)。

4、胆盐、煌绿染料等对大肠杆菌有明显的抑菌作用。

5、抗原构造:大肠杆菌的抗原构造较为复杂,主要有(1)菌体抗原(O抗原),为细菌细胞壁的成分,化学成分属脂多糖,脂多糖的重复寡糖单位在核心多糖外侧,是脂多糖分子的最外层,决定O抗原的特异性。O抗原耐热,加热100℃不能灭活,目前已知O抗原有171种,是血清学分型的基础。(2)鞭毛抗原(H抗原),成分为鞭毛蛋白,不耐热,已知有56种,均为单相菌株。(3)荚膜或包膜(K)抗原,成分以多糖类为主,对热稳定。K抗原的存在时能阻止O凝集,已知有100种,但不是每个菌株都有K抗原。大肠埃希菌的血清型按O:K:H的顺序,以数字表示,如肠出血性大肠杆菌的血清型O157:H7。

6、致病因子:除内毒素、荚膜肠杆菌科共有的毒力因子外,大肠埃希菌具有独特的毒力因子有:黏附素——具有高度特异性,引起吸附-定植-致病;外毒素(由ETEC产生的肠毒素),包括(1)不耐热肠毒素(LT),分LT-I和LT-Ⅱ两型,本质为蛋白质,对热不稳定,与霍乱肠毒素相似;2)耐热肠毒素(ST),分STa、STb两型,为低分子多肽,对热稳定,致病机制为激活细胞鸟苷酸环化酶,使cGMP↑导致腹泻,当LT和ST同时存在,致病性更强。

三、大肠埃希菌的实验室检查及诊断

1、样本采集  采集来自临床的各种标本,如血液、尿液、体液、脓汁、痰和分泌物等

2、分离培养  将血液标本接种于肉汤,生长后再移种于血琼脂平板上,脓汁、痰和分泌物标本与体液(取离心后的沉淀物)标本直接接种于血平板上。尿液标本应同时做菌落计数。于36±1℃培养18~24h,观察菌落。

3、鉴定培养  可将菌液进一步接种于乳糖胆盐培养基或麦康凯、伊红美蓝琼脂平板于36±1℃培养18~24h,观察菌落。不但要注意乳糖发酵的菌落,同时也要注意乳糖不发酵和迟缓发酵的菌落。 

4、生化试验

(1)自(鉴定)平板上直接挑取数个菌落分别接种三糖铁琼脂(TSI)或克氏双糖铁琼脂(KIA)。同时将这些培养物分别接种蛋白胨水、半固体、pH7.2尿素琼脂、KCN肉汤和赖氨酸脱羧酶试验培养基。以上培养物均在36℃培养过夜。

(2)结果:在TSI斜面产酸或不产酸,底层产酸,H2S阴性,KCN阴性和尿素阴性的培养物为大肠埃希氏菌。TSI底层不产酸,或H2S、KCN、尿素有任一项为阳性的培养物,均非大肠埃希氏菌。必要时做氧化酶试验和革兰氏染色。

5、血清学试验

(1)假定试验:挑取经生化试验证实为大肠埃希氏菌的琼脂培养物,用致病性大肠埃希氏菌、侵袭性大肠埃希氏菌和产肠毒素大肠埃希氏菌多价O血清和出血性大肠埃希氏菌O157血清做玻片凝集试验。当与某一种多价O血清凝集时,再与该多价血清所包含的单价O血清做试验。如与某一个单价O血清呈现强凝集反应,即为假定试验阳性。

(2)证实试验:制备O抗原悬液,稀释至与Mac Farland3号比浊管相当的浓度。原效价为1:160~1:320的O血清,用0.5%盐水稀释至1:40。稀释血清与抗原悬液在10mm×75mm试管内等量混合,做单管凝集试验。混匀后放于50℃水浴箱内,经16h后观察结果。如出现凝集,可证实为该O抗原。

6、肠毒素试验:用酶联免疫吸附试验检测LT和ST。

(1)产毒培养:将试验菌株和阳性及阴性对照菌株分别接种于0.6mLCAYE培养基内,37℃振荡培养过夜。加入20000IU/mL的多粘菌素B0.05mL,于37℃1h,离心4000r/min 15min,分离上清液,加入0.1%硫柳汞0.05mL,于4℃保存待用。

(2)LT检测方法(双抗体夹心法) :具体过程参见LT和ST酶标诊断试剂盒,结果判定:以酶标仪在波长492nm下测定吸光度OD值,待测标本OD值大于阴性对照3倍以上为阳性,目测颜色为桔黄色或明显高于阴性对照为阳性。

(3)ST检测方法(抗原竞争法):具体过程参见LT和ST酶标诊断试剂盒,结果判定:以酶标仪在波长492nm下测定吸光度(OD)值:目测无色或明显淡于阴性对照为阳性。

综合以上生化试验、血清学试验、肠毒素试验作出报告。

四、大肠埃希菌的防治及生物安全防护

一、细菌的防治

        首先应正确地处理感染者的粪便,良好的卫生以及用肥皂仔细洗手,有助于限制感染的传播。由于儿童和老人是易感人群,所以一旦出现感染,对其他人的预防措施将是必需的:应将已知感染大肠埃希菌的患者集中看护;采用巴氏法消毒食品,可防止食物源性传播。

        治疗则主要依靠支持疗法.虽然大肠埃希菌对绝大多数常用抗生素敏感,但是抗生素并不能减轻症状,减少带菌或防止HUS发生。在感染后的一周内,对发生HUS高危患者(如不满5岁儿童,年老者),应该观察其早期症状.发生并发症的患者需要精心照料,包括透析和其他特殊的治疗,这些可以在三级医疗护理中心进行。

二、细菌的生物安全防护

        根据《病原微生物生物实验室生物安全管理条例》中的有关规定,人间传播的微生物名录(待颁布)霍乱弧菌属于三类,BSL-2。相关的防护事宜包括:

(1)操作要求

1、实验时,未经实验室主任同意,限制或禁止进入实验室。

2、不许在工作区域饮食、吸烟、清洗隐型眼镜和化妆。食物应存放在工作区域以外专用橱柜或冰箱中。

3、所有的操作过程应尽量细心,避免产生和溅出气溶胶。

4、打碎的器皿不能直接用手处理,必须用其它工具处理,如刷子和簸箕、夹子或镊子。盛污染的针头、锐器、碎玻璃的容器在倒掉前,应按照相关的规定进行消毒。

5、所有的培养物、储存物及其它规定的废物在释放前,均应使用可行的消毒方法进行消毒,如高压灭菌。转移到就近实验室消毒的物料应置于耐用、防漏容器内,密封运出实验室。离开该系统进行消毒的物料,在转移前应包装,其包装应符合有关的法规。

6、溅出或偶然事件中,明显暴露于传染源时,要立即向实验室主任报告。进行适当的医学评估、观察、治疗,保留书面记录。

7、按日常程序、在有关传染源的工作结束后、尤其是传染源溅出或洒出后、或受到其他传染源污染后,实验室设备和工作台面应当使用有效的消毒剂消毒。污染的设备在送去修理、维护前,要按照相关的规定消毒;在离开设施转移前,要按照相关的规定打包运输。

(2)安全设备

1、正确使用和保养生物安全柜、最好是二级生物安全柜、或其他合适的人员防护设施、或物理遏制装置。

2、确定可能形成传染性气溶胶或溅出物的实验过程,包括离心、研磨、匀浆、剧烈震荡或混匀、超声波破裂、开启装有传染源的容器、采集感染标本等。

3、涉及高浓度或大体积的传染源时,若选用密封转头或带安全罩的离心机,若转头或安全罩仅在生物安全柜中打开,则可在开放实验室内离心。

4、当必须在生物安全柜外处理标本时,需采取面部保护措施(跟镜、口罩、面罩、或其他防溅装置),以免传染源或其他有害物溅或洒到面上。

5、在实验室内,必须使用专用的防护性外衣、大褂、罩衫或制服。人员到非实验室区域时,防护服必须留在实验室内。防护服可以在实验室内处理,也可以在洗衣房中洗涤,但不能带回家中。

6、可能接触潜在传染源、被污染的表面或设备时,要戴手套。一次性手套不用清洗、不能重复使用,不能用于接触“洁净”的表面(键盘、电话等),也不应当戴着到实验室外。要备有带滑石粉的乳胶手套。脱掉手套后,要洗手。


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