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日志

 
 

【转帖】军团菌  

2008-07-16 22:58:52|  分类: 细菌 |  标签: |举报 |字号 订阅

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   这是一个来自微生物之家论坛的帖子,感觉很有价值,故转帖至此,特别感谢作者(ququtdr)。

 

揭开军团菌的神秘面纱,她其实是一位绝色美女。

军团菌菌落在黑色背景下显灰白色,黄色非军团菌。

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她的美,在于那一层若有若无的水溶性荧光。只可意味,不可言传。 

在立体显微镜下放大,她其实很有缺点。

她的边缘,有一种“cut-glass”结构。

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有人把“cut-glass”结构,翻译成“毛玻璃”

我笑,他们其实,并不懂军团菌。

其实,若没有这看不见的不规则结构,又怎会折射出美丽的水溶性荧光。 

更有甚者,在长波紫外线下,他们还能激发出美丽的菌落荧光(非水溶性)

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她其实具多形性,有时呈短杆,有时细长,有时菌体间还可以相互粘连,形成发丝结构。

 

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       时间,可能会让美丽消逝……

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关于细菌名字,最好的翻译就是不翻译。

但是,中华系列往往要求翻译成中文。

本打算参考别人的翻译, 结果发现<临床微生物学与临床微生物学检验>,<临床微生物手册>, <原核系统生物学>等多个书目及教材,均翻译得不规范。

以下为个人对50个军团菌种的翻译,欢迎指正。

 

 

英文名   推荐译名   理由
1 L.pneumophila subsp. fraseri 嗜肺军团菌弗氏亚种(人名命名, in honor of David W.Fraser, who headed the investigation of the Legionnaires'disease outbreak in Philadelphia)
L. pneumophila subsp. pasculle 嗜肺军团菌帕氏亚种(人名命名,in honor of A.William Pasculle for his pioneering studies on media, isolation, and nosocomial spread of L.pneumophila and L.micdadei)
L. pneumophila subsp. pneumophila 嗜肺军团菌嗜肺亚种  

      
2 L. adelaidensis 阿德莱德军团菌 (分离于澳大利亚adelaide,地名命名)

3 L. anisa 不同军团菌 (源于希腊语anisos,意为“不均一的”.意指:blue-white autofluorescence is seen in most but not all strains)

4 L. beliardensis 伯里亚德军团菌(分离于法国Montbeliard,地名命名)

5 L. birminghamensis  伯明翰军团菌(分离于美国Birmingham,地名命名)

6 L. bozemanii 波兹曼军团菌  

7 L. brunensis 布尔诺军团菌(分离于捷克的Brno,该地点源于德语的brunen,意即“井”,“泉”)

8 L. busanensis 釜山军团菌(分离于韩国釜山,地名命名)

9 L. cherrii切氏军团菌(分离于美国,以对军团菌具有贡献的Cherry名字命名)

10 L. cincinnatiensis幸幸那提军团菌(分离于美国Cincinnati,地名命名)

11 L. dumoffii 杜氏军团菌  

12 L. erythra红色军团菌
L. rubrilucens 红光军团菌      
长波紫外灯下呈红色荧光,经基因测序鉴定,实为同一个种属的不同亚种。
    
13 L. fairfieldensis费菲军团菌(分离于澳大利亚fairfield,地名命名)

14 L. feeleii 菲氏军团菌 (分离于美国,以对军团菌具有贡献的feeley名字命名)

15 L. geestiana吉斯特军团菌(分离于英国geest公司建筑内)

16 L. gormanii戈氏军团菌(分离于美国,以对军团菌具有贡献的Gorman名字命名)

17 L. gratiana格勒先军团菌或格雷诺贝尔军团菌(离于法国Grenoble,地名命名,该城原拉丁语为Gratianpolis,意为“格勒先之城”,为古罗马皇帝Gratian所建)

18 L. gresilensis 格雷坞军团菌 (离于法国著名温泉小镇Gre′oux,地名命名)

19 L. hackeliae 海氏军团菌 (分离于美国,以对军团菌具有贡献的Hackel名字命名)

20 L. impletisoli 渣土军团菌(分离于日本,废渣填埋场的的工为废水中,因故命名)

21 L. israelensis 以色列军团菌(分离于以色列,地名命名)

22 L. jamestowniensis詹姆斯顿军团菌(分离于美国jamestown,地名命名)

23 L. jordanis乔丹河军团菌(分离于美国印第安大学Boomington分校内的Jordan河,河流名字命名)

24 L. lansingensis兰辛军团菌(分离于美国Lansing,地名命名)

25 L. londiniensis伦敦军团菌????  

26 L. longbeachae长滩军团菌(分离于美国Long beach,地名命名)

27 L. maceachernii 迈氏军团菌(分离于美国,以对军团菌具有贡献的McEACHERN名字命名)

28 L. micdadei 米氏军团菌(分离于美国,以对军团菌具有贡献的McDade名字命名)

29 L. moravica 摩拉维亚军团菌 (分离于捷克, )  

30 L. nautarum 水手军团菌  

31 L. oakridgensis橡树岭军团菌(分离于美国Oak ridge,地名命名 )

32 L.parisiensis巴黎军团菌(分离于法国巴黎,地名命名)

33 L. quateirensis 奎特里拉军团菌(分离于葡萄牙Quarteira,地点命名)

34 L. Legionella quinlivanii 奎氏军团菌(分离于澳大利亚,QUINLIVAN的名字命名)

35 L. sainthelensi圣海伦军团菌(分离于美国Saint Helen,地名命名)

36 L. santicrucis圣克鲁兹军团菌(分离于美国Santa Cruz,地名命名)

37 L. shakespearei莎氏军团菌  

38 L. spiritensis精灵湖军团菌(分离于美国spirit lake,湖泊来源命名)

39 L. steigerwaltii 斯氏军团菌(分离于美国,以对军团菌具有贡献的STEIGERWALT名字命名)

40 L. taurinensis都灵军团菌(分离于意大利Turin, 拉丁名为 Taurinorum,地名命名)

41 L. tucsonensis图森军团菌(分离于美国tucson,地名命名)

42 L. yabuuchiae 薮内氏军团菌(分离于日本,以in honour of Eiko Yabuuchi for her work on Legionella in Japan)

43 L. wadsworthii 华兹华斯军团菌(分离于美国wadsworth医疗中心)

44 L. waltersii 沃氏军团菌(分离于澳大利亚,以对军团菌具有贡献的walters名字命名)

45 L. worsleiensis 沃斯利军团菌(分离于英国Worsley,地名命名)

注:以下为军团菌样微生物, 具有严格的细胞内寄生性,BCYE平板少量生长或不生长.
      
46 L. Drancourtii 姜氏军团菌(Drancourt名字命名)

47 L. drozanskii 爵氏军团菌(drozansk名字命名)  

48 L. fallonii 法氏军团菌(Fallon名字命名)

49 L. lytica 裂解军团菌 (以立克次体的方式得以离,能裂解阿米巴)  

50 L. rowbothamii 罗氏军团菌  (Rowbotham名字命名)

 

嗜肺军团菌最为常见。

嗜肺军团菌对营养的要求,好像并不象传说中的严格,据报道,部分可在巧克力平板上生长。

嗜肺军团菌在BCYE生长很好,培养3天即可形成2~3cm的菌落,随着时间的延长,甚至可达到4~5cm。不过,军团菌生长存在不均衡的现象,同一菌株在同一平板上,有的长得快,有的长得慢。 

嗜肺军团菌在BCYE平板上,培养3天后,粘滞度较大,部分如牙膏样紧附平板,很难挑出,并可拉出长丝。 

嗜肺军团菌触酶实验,反应较慢。一般需要8~30 s 出现气泡。 

嗜肺军团菌马尿酸阳性普遍为阳性

嗜肺军团菌马尿酸实验阳性。

但如采用茚三酮显色法,不能添加任何含蛋白成份的肉汤。

直接将以马尿酸钠溶于蒸馏水中,高压。实验时浊度要在2.0M以上。 

以不含活性炭的BYE肉汤,FeCl3沉淀法进行马尿酸水解实验也许会更好。

 

菲氏军团菌(L.Feeleii)马尿酸水解也可呈弱阳性,但菲氏军团菌菌落不大,一般1cm左右。

一般粘滞度小,挑不出丝。 

据报道,日本2007年新分离的两株军团菌,渣土军团菌及薮内氏军团菌,其他还有一两个种,马尿酸水解阳性。但总的来说,其他几十个种均为阴性。

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第二个常见的是米氏军团菌(L.micdadei)。

该菌可吸咐溴甲酚紫染料。

《微生物学与微生学检验》教材上,以KOH溶解溴甲酚紫,似乎效果不是很好。

实践证明,以酒精溶解染料,添加到培养基中,结果很明显。

下面这张偷懒了,染料是高压的。

【转帖】军团菌 - hampc168 - hampc168

 

对于军团菌,我们常常存在一个误区。

即认为PCR的灵敏度会高于分离培养。

然而,事实也许未必如此。

想想在做PCR的过程中,提取模板的过程中会存在损失。

环境标本、痰标本可能还存在PCR反应的抑制剂。

如果有人说,他的PCR可检测到10个细菌,不用说,这是在造假了。 

而事实上,将0.5M 处于对数增长期的嗜肺军团菌、稀释至10的7次方倍,取0.1ml涂布在BCYE平板,仍会有菌落形成(即1~2个菌落形成单位)。

而采用PCR,以0.5M 的军团菌进行稀释,需要1000个CFU左右,提取模板,方出现阳性。

1000个CFU对数增长期的嗜肺军团菌,在平板上是非常多的了。

此外,PCR不足之处在于,其存在假阳性。

 

0.5M 处于对数增长期的嗜肺军团菌、稀释至10的7次方倍,取0.1ml涂布在BCYE平板:

【转帖】军团菌 - hampc168 - hampc168

 

0.5M 处于对数增长期的嗜肺军团菌、稀释至10的4次方倍,取0.1ml涂布在BCYE平板:

【转帖】军团菌 - hampc168 - hampc168

 

教材上有一种错误的说法,即认为嗜肺军团菌在BCYE平板上可出现黄绿色荧光。

甚至把这个写进了培养基的质控中。

 

而事实上,嗜肺军团菌的这种黄绿色荧光,是水溶性的,在平板上可以扩散。在透明的F-G琼脂或不含活性炭的TS-BYE平板上生长良好时,才会在紫外灯下观测到。加入胱氨酸可增加该荧光现象。

 

培养基棕色色素形成实验,也一样。需要透明的F-G琼脂或含酪氨酸的TS-BYE平板上观察。

 

这里面存在一个矛盾。

首先,部分军团菌具有一定的碳依赖性,需要活性炭,才能生长良好。

但在含活性炭的BCYE平板,显然不能进行棕色色素实验的观察及培养基的黄绿荧光的观察。

而F-G琼脂或含酪氨酸的TS-BYE平板均不活性炭,最好多挑细菌接种。否则会出现假阴性。

但总而言之,这两个实验不稳定,有待于改正。

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通过生化表型鉴定,结合实践经验,要区分出嗜肺军团菌,非嗜肺军团菌,还是很简单的。

此外,米氏军团菌BCP阳性,菲氏军团菌明胶液化阴性,橡树岭军团菌动力鞭毛阴性,生化反应相对比较特殊。

还有那些在长波紫外的蓝白荧光现象等,这具有初步分类鉴定价值。

但生化实验的鉴定价值有限,包括蓝白荧光现象,多个实验均存在不稳定性。

当然,mip测序鉴定的结果非常直观。

但一般的实验室,都不具备这个实力。

因此,在普通的实验室,建议只鉴定到军团菌属。

 

 

在FoX与brown在1989年的文献报道中,以TS-BYE平板进行淀粉酶实验,结论是嗜肺军团菌呈阳性,米氏军团菌呈阴性,另还有其他部分呈阴性。但这个结论可能是错误的。我采用与马尿酸钠水解实验一样的方法,直接溶解淀粉高压,配成2.0M单位菌液进行实验。做了100多株菌,且包括米氏军团菌标准菌株,NCTC11371,但除了空白对照外,所有的菌株在加入碘后,颜色均消失。只是消失的时间长短有差别。由此推断,军团菌生化反应不稳定,可能与生长状态有关。 

参考文献:

Fox KF, Brown A. Application of numerical systematics to the phenotypic differentiation of legionellae. J Clin Microbiol. 1989,27:1952-1955.

 

呵呵,说说BCYEα培养基的制备吧。

BD公司与OXoid公司均有基础粉。

 

以下这个配制,翻译自ISO-11371

 

 

 

1.1.2  BCYEα培养基的制备

BCYEα培养基配方:

酵母浸膏(细菌级)

10g

琼脂

12g

活性碳

2g

α-酮戊二酸钾

1g

ACES(N-2-乙酰胺-2-胺基乙醇磺酸)

10g

KOH

2.8g

L-半胱酸·1H2O·HCl

0.4g

焦磷酸铁[Fe4P2O7]

0.25g

溴甲酚紫

0.1mg

溴麝香草酚蓝

0.1mg

蒸馏水

1000ml

BCYEα培养基的配制如下:

a) 半胱氨酸和铁盐溶液的配制

分别加入0.4g L-半胱氨酸、0.25g 焦磷酸铁到10ml蒸馏水配制成新鲜溶液。使用孔径为0.45μm的纤维素膜滤器进行过滤除菌。干净无菌的容器-20℃储存,储存时间不超过三天。 

 b) ACES 缓冲液的配制

在500ml蒸馏水中加入ACES颗粒,45 ~50℃水浴使其溶解。另在480ml蒸馏水中加入所有氢氧化钾颗粒,轻摇使其溶解。混合上述两种溶液得到ACES缓冲液。

注:如果不进行以下步骤,ACES缓冲液将导致酵母浸膏发生变性。

c) 最终培养基

在980mlACES缓冲液中先加入活性炭酵母浸膏,然后加入α-酮戊二酸。在1L蒸馏水中溶解5.6g KOH得到0.1M的溶液。在1L蒸馏水中小心地加入5.3ml H2SO4得到0.1M的硫酸溶液。使用0.1M的氢氧化钾溶液或0.1M硫酸溶液调整PH值为6.8。加入琼脂,混匀,121℃高压蒸汽灭菌15min。在水浴中冷却到50℃,无菌操作,加入L-半胱氨酸、焦磷酸铁,使各种成份混匀。

d) 培养基的质量控制

培养基成份的批次之间的差异可能影响其培养效果(尤其是α-酮戊二酸)。因此,对于每一批新鲜配制的培养基,检查其三日之内嗜肺军团菌血清型1(L . pneumophia serogroup 1)的生长状况有重要的意义。

 

培养基,对于细菌的培养至关重要。

如果对空调水采样,阳性率为0%,那么可以肯定是培养基有问题。

 

对于培养基的质量控制,我个人认为,可以这样进行质控。

 

将嗜肺军团菌配成0.5M浊度,稀释至10的7次方倍,取0.1ml涂布在BCYE平板,仍会有菌落形成,那么可认为培养基质量很好。要是稀释至10的响5或6次方倍,就没有菌落形成,可认为是不合格了。

 

当然,最好的方法,就是你选一份阳性水样,能培养出军团菌。

而我的经验是,公园里面的鲤鱼池,也就是可以人工喂食的地方,军团菌阳性率几乎为100%。当然,这是经验,有待考证。

取这样一份水样,先在37度左右放置3~4天。

然后离心,取沉淀,酸处理后,接种就OK。

 

 

下面是选择性培养基。

当然,还可以加入染料。   

1.1.4  选择性BCYEα-GVPC培养基

选择性抗生素成份的终浓度:

甘氨酸

3g/L

硫酸多粘菌素B

80,000 IU/L

盐酸万古霉素

0.001g/L

放线菌酮

0.08 g/L

按照1.1.2中的方法准备BCYEα培养基,加入α-酮戊二酸之后再加入3g甘氨酸,然后将PH值调整至6.9。加入L-半胱氨酸、铁之后,在终溶液中加入以上三种抗生素储存液各1体积,混合。

 

我个人感觉,放线菌酮对军团菌生长具有一定影响。但不加放线菌酮,真菌孢子可以快速繁殖。 

基本上,BCYEα-GVPC培养基,军团菌生长可较纯。可惜,上一批没有拍照。

以下是一张没加入放线菌酮的照片。

【转帖】军团菌 - hampc168 - hampc168

 

 

军团菌容易在管水管道内滋生。主要以气溶胶传播。

室内中央空调、喷泉、淋浴喷头等,在使用的过程中,可产生含军团菌的气溶胶。人体吸入后,可引起肺炎或庞蒂克热。此外,直接饮用或创面接触含军团菌的水源也可能引起肺外感染。

 

一般认为开展军团菌,对实验室设备要求很高。

而事实上,军团菌在外环境中的存在,是非常广泛的。

在环境标本、临床标本的处理过程中,不会产生水雾,当然,也不会产生含军团菌的气溶胶。

因此,军团菌检测还是非常“安全”的。ISO-11371对军团菌的生物安全级别要求为二级。

 

 

军团菌由于不能在MH平板上生长,因此作为一种苛养菌,目前还没药敏试验的标准。因此,只要求鉴定是否为军团菌。一般以红霉素治疗。 

以下为我国的国标:

点击浏览该文件:军团病诊断标准及处理原则.doc

以下为英国的国标。

点击浏览该文件:军团菌临床标本处理bsop47.pdf

 

由于我们国标中,所附录的方法,其思想理论不是很新颖,及实验价值有限。

我建议采用环境标本的鉴定方法,采用以下三步骤。

低倍立体显微镜观察其“cut-glass”结构——可疑菌落同时接种BCYE及血平板——纯菌株辅以PCR鉴定、血清学试验鉴定。当然,也可以进一步对纯菌株进行测序。

 

oxoid 可购买基础粉,也出售培养基成品。

但其培养基成品的价格比较贵。

国内市面上也有军团菌的平板,但就我以前所用过的,其质量确实不敢恭维。

估计国内,生产平板的公司,没有做培养基质量控制的习惯。

 

 

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